生物化學 第三節(jié)核酸的理化性質

第三節(jié)核酸的理化性質一、核酸的分子大小

不同的生物的DNA分子的大小形狀各有不同，下表列出了某些DNA分子的大小以及構象。DNA來源分子量長度堿基數

構象大腸桿菌染色體2.2*1091.3mm3*106環(huán)狀雙鏈流感嗜血桿菌染色體8*108300μm1.2*106

雙鏈支原體PPLO株H-394*108150μm6*105

雙鏈噬菌體T2或T41.3*10850μm2*105線狀雙鏈噬菌體λ3.3*10713μm0.5*105線狀雙鏈噬菌體ΦΧ1741.6*1060.6μm---環(huán)狀雙鏈多瘤病毒3*1061.1μm4.6*103環(huán)狀雙鏈小鼠線粒體9.5*1065μm1.4*104線狀雙鏈果蠅巨染色體8*10104.0cm1.2*108線狀雙鏈人第13對染色體6.4*10103.2cm9.6*107線狀雙鏈二、核酸的溶解度與粘度核酸都微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑。因此在提取核酸時往往用氯仿抽提，乙醇沉淀的方法---實驗3動物組織中核酸的提取與鑒定。

DNA溶液粘度極大，RNA分子短于DNA，且無定形，所以溶液粘度小于DNA溶液。DNA變性，粘度降低，所以可以用粘度作為DNA變性的指標。三、核酸的酸堿性質

多核苷酸中兩個單核苷酸殘基之間的磷酸殘基解離時具有較低的pK’值，全部解離時呈多陰離子狀態(tài)。所以可以把核酸看成是多元酸，具有較強的酸性。多陰離子狀態(tài)的核酸可與金屬離子結合成鹽。與蛋白質相似，核酸分子中既含有酸性基團（磷酸基）也含有堿性基團（堿基上的氨基），因而核酸也具有兩性性質。由于核酸分子中的磷酸是一個中等強度的酸，而堿基上的氨基是一個弱堿，所以核酸的等電點比較低。如DNA的等電點為4～4.5，RNA的等電點為2～2.5。四、核酸的紫外吸收

由于核酸的組成成分嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵．有強烈的紫外吸收，所以核酸也有強烈的紫外吸收。最大吸收值在260nm，

而蛋白質的最大吸收值在280nm。

核酸變性時，e(p)值顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(hyperchromiceffect)。在一定條件下，變性核酸可以復性，此時e(p)值又回復至原來水平，這種現(xiàn)象稱為減色效應(hypochromiceffect)。所以e(p)值可以作為核酸復性的指標。

實驗室常用的技術指標（補）核酸在260nm和蛋白質在280nm有最大吸收峰，在實驗室中應用最多。可用于定性定量測定核酸和蛋白質，以及判定樣品純度（OD260nm/OD280nm）；純DNA的OD260nm/OD280nm應為1.8，純RNA應為2.0。通常1OD值相當于50ug/ml雙螺旋DNA，或40ug/ml單螺旋DNA（或RNA）或20ug/ml多核苷酸。

五、核酸的變性、復性和雜交(一)變性(denaturation)

1.概念核酸的變性是指維持核酸空間結構的作用力氫鍵和堿基堆積力被某些理化因素破壞，使核酸的空間結構改變，從而引起核酸理化性質和生物學功能的改變。核酸變性時，雙螺旋結構解開，但并不涉及核苷酸間共價鍵的斷裂，因此變性作用并不引起核酸分子量的降低。多核苷酸鏈的斷裂叫降解，伴隨核酸的降解，核酸分子量降低。2.引起變性的因素多種因素可引起變性。如加熱、pH值、有機溶劑等。由溫度升高引起的變性稱為熱變性。酸堿度改變引起的稱為酸堿變性。尿素是測定DNA序列時，所用的聚丙烯酰胺凝膠電泳法中常用的變性劑。甲醛也常用于瓊脂糖凝膠電泳，測定RNA的分子大小。3.變性導致理化性質改變增色效應Tm值粘度降低旋光性降低沉降系數S增加浮力密度大大增加

DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結構中堿基藏入內側，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產生增色效應。

對雙鏈DNA進行加熱變性，當溫度升高到一定程度時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，吸光度也不再明顯變化。Tm值DNA熱變性的過程是一種“躍變”過程，即變性作用不是隨溫度的升高徐徐發(fā)生的，而是在一個很狹窄的臨界溫度范圍內突然引起變化并很快完成的。通常把e(p)值達到最高值的1/2時的溫度稱為“熔點”或熔解溫度(meltingtemperature)，用Tm表示。DNA的Tm值一般在70-85℃之間。(二)復性(renaturation)變性DNA在適當的條件下，可使兩條彼此分開的鏈重新由氫鍵連接而形成雙螺旋結構，這一過程叫復性。它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為退火(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成。復性后，粘度增高，生物活性部分恢復。(三)核酸的雜交(hybridization)將不同來源的DNA經熱變性，冷卻，使其復性，在復性時，如果這些異源DNA之間在某些區(qū)域有相同的序列，則會形成雜交DNA分子。DNA與互補的RNA之間也會發(fā)生雜交(P131)。1.Southernblotting由英國分子生物學家Southern創(chuàng)立。將凝膠電泳分離的DNA片斷轉移至硝酸纖維素膜上后，再進行雜交。2.Northernblotting將RNA經電泳變性后轉移至纖維素膜上再進行雜交。3.Westernblotting用類似的方法，根據抗原和抗體結合的原理，可以來分析蛋白質。

以DNA-DNA雜交為例，較詳細地介紹Southern印跡法。 將DNA樣品經限制性內切酶降解后，用瓊脂糖凝膠電泳進行分離。將膠浸泡在堿(NaOH)溶液中使DNA進行變性，然后將變性DNA轉移到硝酸纖維素膜上(硝酸纖維素膜只吸附變性DNA)，在80℃烤4~6小時，使DNA