新陳代謝 DNA生物合成學習課件

第十章核酸的生物合成術(shù)語簡介基因和蛋白質(zhì)的命名縮寫：

1）基因通常用3個能反映其基本功能的斜體小寫字母表示。如：dna

基因影響DNA的復制，rec

基因影響DNA的重組。當幾個基因影響同一過程時，通常按發(fā)現(xiàn)的先后順序加上A、B、C等。

2）對基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物命名，不用斜體，且第1個字母大寫。如：dnaA和recA基因的產(chǎn)物叫做DnaA和RecA

。模板（template）:一種使分子能按一定順序排列并連接形成有特定序列和功能的生物大分子的結(jié)構(gòu)。第一節(jié)DNA的生物合成一.DNA的半保留復制

Watson和Crick開創(chuàng)性的論文，對DNA雙螺旋的描述以這樣一段陳述結(jié)尾：“不出我們的意料，我們所假設的特異性配對立即提示一種遺傳物質(zhì)可能的復制機制?！?/p>

復制時,每一條DNA鏈在新鏈合成中充當模板，按堿基配對方式形成兩個新的DNA分子，每個分子都含有一條新鏈和一條舊鏈，這種復制方式即半保留復制(semiconservativereplication)。DNA復制可能的三種方式新鏈舊鏈DNA的半保留復制的生物學意義：DNA的半保留復制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。

（但DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物質(zhì)。）DNAReplication半保留復制親代第一代第二代半保留復制的實驗證據(jù)

1958年Meselson和Stahl用同位素15N標記大腸桿菌DNA，首先證明了DNA的半保留復制。由Meselson和Stahl設計證明半保留復制的實驗被譽為生物學最美麗的實驗Meselson和Stahl于42年以后在最初他們相遇的一顆樹下重逢時的合影Meselson

和Stahl的證明DNA半保留復制的實驗流程

重輕雜和

DNA雜和DNA二.復制的起點和方向

復制是一個高度協(xié)調(diào)的過程，母鏈解鏈和復制同時進行。（一）概念●復制子(replicon)：基因組能獨立進行復制的單位。●起點(origin)：控制復制起始，是含有100～200個堿基對的一段DNA。細胞內(nèi)存在著能識別起點的特殊蛋白質(zhì)(大腸桿菌中稱為DnaA蛋白)?！窠K點(terminus)：終止復制的序列位點.●復制叉(replicationfork)：復制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進行復制，形成在顯微鏡下可看到的叉狀結(jié)構(gòu)。原核生物：只有一個復制子真核生物：多個復制子，多個起點，形成多個“復制眼”或“復制泡”（二）起始點和方向

1.原核生物和真核生物復制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大腸桿菌起始點有固定的保守順序GATC和TTATCCACA，多次出現(xiàn)，可被酶識別。

2.方向：大多是雙向、對稱復制,也有單向或不對稱的。

3.速度：原核生物復制叉移動快(約105bp/min);

真核生物復制叉移動慢

(約5×102～5×103bp/min)雙向復制復制叉起點起點單向復制復制起始點、復制子與復制叉（動畫演示）概述----DNA復制的一般特征以原來的DNA兩條鏈作為模板，4種dNTP為前體，需要Mg2＋模板DNA需要解鏈半保留復制需要引物——主要是RNA，少數(shù)是蛋白質(zhì)復制的方向始終是5′→3′具有固定的起點多為雙向復制，少數(shù)為單向復制半不連續(xù)性具有高度的忠實性和進行性三.原核細胞DNA的復制(DNA指導下的DNA合成)（一）DNA聚合酶(DNApolymerase,DNA-pol

)DNA聚合酶是一種催化依賴模板的由脫氧核苷三磷酸前體合成DNA的酶。1956年Arthurkornberg

等首先從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，其后在廣泛不同的生物中都找到有這種酶。——以大腸桿菌為代表的“θ-復制”系統(tǒng)為例

★DNA聚合酶的反應特點：?

4種dNTP底物：(dATP

dGTP

dCTP

dTTP);?

接受模板指導:

解開成單鏈的DNA母鏈；?

需引物提供3′-OH；?

新鏈生長方向：5′→3′；?

產(chǎn)物DNA性質(zhì)與模板相同。

此外,DNA復制過程中還需其它酶和蛋白質(zhì)因子.模板DNA鏈引物新加入的dNTP脫氧核糖親核攻擊5′3′生長的DNA鏈*

引物(primer)是一個和模板鏈互補的線性片段,其上帶有能與核苷酸相結(jié)合的游離3'-OH.引物通常是寡聚RNA.ArthurKornbergWonthe1959NobelPrizeinMedicineforhisdiscoveryofthemechanisminthebiologicalsynthesisofdeoxyribonucleicacid

(beforeWatsonandCrickwontheirs!)1908-2007，Standford大學醫(yī)學院終身教授1.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ—polⅠ

也稱Kornberg酶,是各種DNA聚合酶中研究最透徹的，它的一些特點代表了DNA聚合酶的基本特點：（1）polⅠ的性質(zhì)分子量：103000，單鏈，球形，活性部位含Zn2＋，電鏡下可以看到二聚體，每個細胞有400個酶分子。（2）功能：

①

5′→3′聚合酶活性；酶與模板結(jié)合后構(gòu)象改變，識別堿基，正確配對后才發(fā)揮聚合作用(對底物進行專一性核對)②

3′→

5′外切酶活性；主要是對新生DNA鏈進行校對，防止“錯配”③

5′→3′外切酶活性。主要是對DNA損傷的修復，以及在DNA復制時RNA引物的切除及其空隙的填補可見，DNApolⅠ是1個多功能酶。（DNA復制過程中堿基配對要受到①②雙重核對）模板聚合酶活性位點引物3′→5′外切酶位點DNA聚合酶的聚合和校對

DNA聚合酶折疊成幾個不同的結(jié)構(gòu)域HansKlenow

使用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶處理DNA聚合酶I，得到大小兩個片段：大片段被稱為Klenow片段或Klenow酶，它含有大小兩個結(jié)構(gòu)域，其中小結(jié)構(gòu)域具有3'→5'外切酶活性，大結(jié)構(gòu)域具有5'→3'聚合酶活性；小片段只有5'→3'外切酶活性。TomSteitz等得到了Klenow酶的晶體結(jié)構(gòu)

2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ——polⅡ(1)多亞基,聚合酶亞基(單鏈)分子量為88000,

每個細胞有100個酶分子（2）功能：

①

5′→3′聚合酶活性；

②

3′→5′外切酶活性。

（該酶無5′→3′外切酶活性;且活性低）

目前認為該酶主要參與DNA損傷的修復。3.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ——polⅢ

真正的DNA復制酶，1972年發(fā)現(xiàn)（1）polⅢ是真正起復制作用的酶，由10種亞基組成不對稱二聚體,α、ε、θ組成核心酶（2）功能：

①

5′→3′聚合酶活性；

②

3′→5′外切酶活性。

該酶在原核細胞中主要負責DNA鏈的延伸，是復制延長中真正起催化作用的酶。

(該酶無5′→3′外切酶活性)

E.coliDNA

聚合酶Ⅲ不對稱二聚體

ε

''

ε

可滑動的夾持器亞基催化亞基3′→5′外切酶亞基前導鏈合成后隨鏈合成夾持器裝置催化亞基

亞基保持核心酶的二聚體結(jié)構(gòu)α亞基具有5′→3′方向合成DNA的催化活性ε亞基具有3′→5′外切酶活性，起校對功能，可提高聚合酶Ⅲ復制DNA的保真性亞基可能起組建的作用β亞基猶如夾子，功能是識別引物、夾住DNA

分子向前滑動

亞基起著促使核心酶二聚化的作用其余的亞基構(gòu)成-復合物，主要功能是幫助亞基夾住DNA（也稱夾子裝置器），并有增強核心酶活性的作用DNA聚合酶polⅠpolⅡpolⅢ

亞基數(shù)目1≥7≥105′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+-

-聚合速度(核苷酸/分)1000-1200240015000-60000

持續(xù)合成能力3-2001500≥500000功能切除引物,修復修復復制表大腸桿菌3種DNA聚合酶性質(zhì)比較已在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)5種不同的DNA聚合酶

DNAPI:

占聚合酶總活性的90%DNAPII:

在DNA修復中起作用(1999年證明)DNAPIII:

主要的DNA復制酶

DNAPIV:

在DNA修復中起作用(在1999年發(fā)現(xiàn))DNAPV:

在DNA修復中起作用(在1999年發(fā)現(xiàn))

DNA聚合酶家族1、岡崎片段和半不連續(xù)復制（1）岡崎片段(Okazakifragment)：

在不連續(xù)的后隨鏈DNA合成中形成的DNA短片段，在原核生物有1000～2000核苷酸，真核生物約100～200核苷酸。1968年岡崎發(fā)現(xiàn)。

（二）雙鏈DNA復制的分子機制（2）DNA的半不連續(xù)復制(semidiscontinuous

replication)：

DNA雙鏈復制時，一條鏈是連續(xù)合成的(前導鏈,leadingstrand),另一條鏈是不連續(xù)合成的(滯后鏈或后隨鏈,laggingstrand),這種前導鏈的連續(xù)復制和后隨鏈的不連續(xù)復制方式稱DNA的半不連續(xù)復制。3

5

3

5

3′5′3′5′解鏈方向領頭鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)DNA的半不連續(xù)復制3′5′復制叉起點復制叉延伸延伸起點領頭鏈領頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’3’5’DNA的雙向復制5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’2、DNA半不連續(xù)復制中的RNA引物（1）前導鏈和滯后鏈的合成都需要RNA引物。（2）引物合成酶(引發(fā)酶，DnaG)：是以DNA為模板的RNA聚合酶（合成方向5′→3′）,合成的引物長度為5～10多個nt。

(3)引物RNA的起始和終止的位置受解鏈酶、引發(fā)酶、模板順序及其二級結(jié)構(gòu)的影響。（4）DNA聚合酶Ⅰ切除前導鏈及岡崎片段的引物后,填補空缺，由DNA連接酶將切口連接。

RNA引物的合成稱作“引發(fā)”。

后隨鏈的合成需多次引發(fā)作用，而發(fā)動前導鏈的合成只需一次引發(fā)。

前導鏈的引物一般比岡崎片段的引物略長一些，前者大約為10～60nt，后者通常為幾個～10多個nt。

成熟的DNA是不含RNA的，RNA引物最終被DNA所置換。3、DNA連接酶（ligase）催化兩段DNA之間的連接:35535353HOP

DNAligaseNADATPNMNAMP+PPi′′′′′′′′+

DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口,一端是3′-OH,另一端是5′-磷酸基,連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。

但它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來。

大腸桿菌和其它細菌的DNA連接酶需要NAD+提供能量;在真核生物、病毒和噬菌體中，則要ATP提供能量。3'5'3'5'OHP4.母本DNA雙鏈的分離

(1)DNA解鏈酶(解螺旋酶,DNAhelicase,DnaB)：通過水解ATP將復制叉前方的DNA雙鏈打開。每解開一對堿基需要水解2個ATP分子。

(2)單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復性和保護單鏈不被核酸酶降解。

(3)DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)或拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(typeⅡ

topoisomerase):兼有內(nèi)切酶和連接酶活性,可迅速使DNA兩條鏈斷開又接上,消除解鏈酶產(chǎn)生的拓撲張力。當引入負超螺旋時需要由ATP提供能量,同復制有關(guān)。除連環(huán)數(shù)（L）不同其他性質(zhì)均相同的DNA分子稱拓撲異構(gòu)體DNA拓撲異構(gòu)酶：通過對一條或兩條雙脫氧核苷酸鏈切斷和再連接向雙螺旋中引入或去除旋轉(zhuǎn)的酶?？偨Y(jié):

原核生物DNA的復制過程:(以大腸桿菌為例)●雙鏈的解開●起始----RNA引物的合成●

DNA鏈的延伸●終止參與大腸桿菌DNA復制的主要蛋白質(zhì)或酶的名稱和功能蛋白質(zhì)名稱功能DNA旋轉(zhuǎn)酶II型拓撲異構(gòu)酶，負責清除復制叉前進中的拓撲學障礙SSB單鏈結(jié)合蛋白DnaA蛋白復制起始因子，識別復制起始區(qū)OriCDnaB蛋白DNA解鏈酶DnaC蛋白招募DnaB蛋白到復制叉DnaG蛋白DNA引發(fā)酶，引物合成DnaT蛋白輔助DnaC蛋白的作用HU蛋白類似于真核細胞的組蛋白，結(jié)合DNA并使DNA彎曲PriA蛋白引發(fā)體的裝配PriB蛋白引發(fā)體的裝配PriC蛋白引發(fā)體的裝配DNA聚合酶IIIDNA鏈的延伸DNA聚合酶I切除引物，填補空隙DNA連接酶縫合相鄰的岡崎片段DNA拓撲異構(gòu)酶IV分離子代DNARep蛋白DNA解鏈酶Tus復制終止B.RNA引物的合成引發(fā)體先與DNA起始部位雙鏈結(jié)合，通過引物合成酶形成前導鏈引物后，再沿5′→3′模板鏈與復制叉同向移動，在移動中斷斷續(xù)續(xù)形成岡崎片段的RNA引物。A.雙鏈的解開

DNA旋轉(zhuǎn)酶(拓撲異構(gòu)酶Π)、DNA解鏈酶、單鏈結(jié)合蛋白協(xié)同作用大腸桿菌DNA復制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)

大腸桿菌DNA復制過程中引發(fā)體的形成

大腸桿菌DNA復制過程中復制體的形成

C.DNA鏈的延伸

在DNApolШ的催化下，以四種dNTP為底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時進行領頭鏈和后隨鏈的合成。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol①前導鏈的延長：

DNApolⅢ全酶二聚體的一個亞基與前導鏈的模板結(jié)合而發(fā)揮催化作用，與復制叉同向。②滯后鏈的延長:DNA

pol

Ⅲ全酶二聚體的另一亞基與形成一個環(huán)的滯后鏈的模板結(jié)合發(fā)揮催化作用。

由于模板形成環(huán),酶向前移動時,滯后鏈合成片段也沿5′→3′方向生長,與酶催化方向一致。滯后鏈片段合成接近前方滯后鏈片段5′末端時,模板被釋放,環(huán)消失。繼續(xù)重復,連續(xù)進行。大腸桿菌DNA復制的延伸

DNA聚合酶Ⅲ催化領頭鏈和隨從鏈同時合成?當新形成的岡崎片段延長至一定長度,其3′-OH遇到上一個岡崎片段時即停止合成。?一旦岡崎片段合成完成，其RNA引物即被除去，通過DNA聚合酶Ⅰ催化合成DNA取而代之，并形成一個切口，此切口由DNA連接酶連接封閉。D.復制終止

細菌環(huán)狀染色體的兩個復制叉向前推移，在終止區(qū)相遇而停止復制，復制體解體。

這樣,以兩條親代DNA鏈為模板，各自形成一條新的DNA互補鏈，結(jié)果形成了兩個DNA雙股螺旋分子。

就目前所知，起始階段是DNA復制中唯一一個可以受調(diào)節(jié)的階段，由于受到調(diào)節(jié)而使得DNA在一個細胞周期中只發(fā)生一次復制。細菌復制終止區(qū)含有多個約22bp的終止子(terminator)位點，E.coli有6個終止子位點。大腸桿菌DNA復制終止區(qū)的結(jié)構(gòu)

復制的保真性(fidelity)(忠實性)主要依賴5種機制：5.DNA復制的高度忠實性

大腸桿菌DNA復制錯配率約10-9~10-10。其染色體中有4.5×106bp，平均每1000～10000個細胞經(jīng)過一次分裂才會插入一個不正確的堿基。（1）四種dNTPs濃度的平衡（2）DNA聚合酶的高度選擇性（3）DNA聚合酶的自我校對(proofreading)（4）錯配修復（5）使用RNA作為引物并最終被切除、置換小結(jié)－維持DNA復制準確性的因素：內(nèi)因:①按堿基配對原則(錯配率10-4~10-5)②DNA聚合酶的作用(錯配率10-4~10-5)

?對堿基的識別作用----選擇正確的堿基參入到引物末端

?對底物的識別作用----先識別引物最后一個堿基是否正確,后識別參入的dNTP是否正確

?校正閱讀----3′→5′外切酶的作用③RNA引物最終被切除,提高了復制準確性④復制完成后對錯配堿基進行修復的酶系統(tǒng)外因：

?四種dNTP要平衡；

?Mn2+和Mg2+的比例、濃度（酶活）(一)真核生物的DNA聚合酶:至少5種---

αβγδεDNA-polα－－現(xiàn)認為其功能只是合成引物DNA-pol

δ－－在復制延長中起催化作用DNA-polε－－校對、修復、填補(類似E.coliDNApolI)DNA-polγ

－－線粒體DNA合成DNA-polβ－－核DNA修復

四、真核細胞DNA的復制－－（DNA指導下的DNA合成）推測在復制叉上有一個DNApolα,以合成引物;

兩個DNApolδ,分別合成前導鏈和滯后鏈。真核細胞DNA復制叉的結(jié)構(gòu)模型

(復制因子C)(復制蛋白A)(增殖細胞核抗原)MF-1微小染色體維持蛋白（二）真核生物中DNA的復制特點1、真核生物染色體有多個復制起點，多復制眼，呈雙向復制，多復制子。2、岡崎片段長約200bp.3、真核生物DNA復制速度比原核慢。4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制；而在快速生長的原核中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點。5、真核生物有多種DNA聚合酶。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接。由端粒酶負責新合成鏈5

端RNA引物切除后的填補，亦保持端粒的一定長度。端粒(telomere)是真核生物線性染色體的兩個末端所具有的特殊結(jié)構(gòu),其共同特點是一條鏈上富含T、G短序列的多次重復,而其互補鏈上富含A、C。（三）端粒的復制端粒端粒中心粒圖真核生物染色體端粒由端粒DNA和蛋白質(zhì)組成端粒主要有兩大生理功能：（1）維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，防止染色體被核酸酶降解及染色體間相互融和。（2）防止染色體結(jié)構(gòu)基因在復制時丟失，解決了末端復制的難題。

DNA復制時，DNA聚合酶必須在RNA引物基礎上從5′向3′方向延伸，而5′端RNA引物去除后因無引物的存在而不能復制，結(jié)果每復制一次染色體末端將丟失一段序列。端粒的存在使每次丟失的僅為端粒的一部分，從而保護了染色體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)基因。另外，有些研究還顯示，端粒與核運動有關(guān)，可能對同源染色體的配對重組有重要意義。端粒的合成主要依靠端粒酶來催化。線性DNA在復制完成后，其5′末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進行延長反應。5

3

3

55

3

3

5端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復合體,它可以其RNA為模板,通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進行延長。端粒酶的結(jié)構(gòu)模型

端聚酶的作用機理

端粒酶的爬行模型（動畫演示）母鏈藉非標準堿基配對回折DNA聚合酶端粒合成完成進一步加工如上圖所示,(a)端粒酶以其RNA為模板,通過逆轉(zhuǎn)錄作用,催化富含G鏈的延伸;(b)端粒酶向端粒新3′端移動,繼續(xù)以其RNA為模板,催化富含G的DNA母鏈延長;(c)端粒酶反復移位,通過逆轉(zhuǎn)錄反應使端粒富含G鏈增長到足夠長度;(d)富含C鏈的空缺部分不需要引物酶合成引物提供3′-OH,而是富含G的鏈突出的寡脫氧核苷酸d(GGGGTTTTGGGG)通過非Watson-Crick配對方式自身的GGGG之間按G·G配對,回折形成發(fā)卡并提供3′-OH;(e)由發(fā)卡引發(fā)富含C鏈在3′-OH以富含G鏈為模板,由DNA聚合酶添加新的dNTP,進一步延伸填補空缺,間隙最后由DNA連接酶封口;(f)端粒DNA與端粒蛋白結(jié)合,完成加工后,形成完整的端粒。

如上圖所示,(a)端粒酶以其RNA為模板,使用右邊的AAC與新?lián)饺氲腡TG配對,催化富含G鏈的延伸;(b)端粒酶向端粒新3′端移動,此時模板RNA左邊的AAC與3′端新?lián)饺氲腡TG配對;(c)端粒酶在模板RNA指導下將6個一組GGGTGG添加到端粒G鏈3′端,重復(a)～(c)反應使端粒富含G鏈增長;(d)富含G鏈充分延伸,而空缺的富含C鏈部分由引物酶合成引物RNA,其序列互補于富含G鏈3′端;(e)在新合成引物引發(fā)下,DNA聚合酶合成DNA用以填補端粒富含C鏈的缺口;(f)引物被切除后,對應的富含G鏈突出10～16個核苷酸;(g)這種帶重復序列的端粒DNA與端粒蛋白結(jié)合后,通過G·G配對自身回折在染色體末端形成套索結(jié)構(gòu)(t環(huán),telomereloop)。

端粒酶活性與細胞分裂能力的關(guān)系

歸納：生物細胞DNA復制分子機制的基本特點五、反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導的DNA合成）定義:以RNA為模板,按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過程稱為反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription,RT，逆轉(zhuǎn)錄)。該過程由反轉(zhuǎn)錄酶催化進行。1970年Temin和Baltimore同時分別從(雞)勞氏肉瘤病毒（RSV）和小白鼠白血病病毒（MLV）等致病RNA病毒中分離出反轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有反轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu)+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄過程

（以前病毒形式整合到宿主細胞DNA中而使細胞惡性轉(zhuǎn)化）

單鏈病毒RNA

RNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：

RNA指導的DNA聚合酶活性

DNA指導的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5′和3′兩個方向起核酸內(nèi)切酶的作用，產(chǎn)生末端為3′羥基和5′磷酸的產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣,沿5′

3′方向合成

DNA,并要求短鏈RNA作引物。

cDNA：利用反轉(zhuǎn)錄酶可合成出與任何RNA模板（mRNA，tRNA或rRNA）的堿基序列互補的DNA－－互補DNA（complementaryDNA,cDNA）。

幾乎所有真核生物mRNA分子的3'末端都有一段polyA,當加入寡聚dT作為引物時，mRNA就可作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下在體外合成與其互補的cDNA，為研究真核結(jié)構(gòu)基因提供了有效途徑。反轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論和實踐意義：①補充和豐富了“中心法則”，不能將其絕對化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。②促進了分子生物學、生物化學和病毒學的研究，為腫瘤的防治提供了新的線索。③目前反轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究這些學科的有力工具。六、DNA的損傷修復?DNA的損傷：DNA在復制時產(chǎn)生錯配、病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學誘變等，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而影響DNA的復制，并使DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯也跟著變化，因而表現(xiàn)出異常的特征（生物突變）。?若DNA的損傷或錯配得不到修復，會導致DNA突變。其主要形式：一個或幾個堿基被置換插入一個或幾個堿基一個或多個堿基對缺失?DNA的損傷修復——

5種修復系統(tǒng):錯配修復、直接修復、切除修復、重組修復和易錯修復。錯配修復：修復DNA中堿基錯配的酶系統(tǒng)。其過程是：識別出不正確的鏈，切除掉不正確鏈的部分，然后通過DNA聚合酶和DNA連接酶的作用，合成正確配對的雙鏈DNA。直接修復(光復活修復)：400nm左右的光激活光復活酶，專一分解紫外光照射引起的同一條鏈上的TT（或CC，CT）二聚體。（包括從單細胞生物到鳥類，而高等哺乳動物無）切除修復：將DNA分子中的受損傷部分切除，以完整的那條鏈為模板再重新合成。特異內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA連接酶均參與。（發(fā)生在DNA復制前）重組修復（發(fā)生在復制后）：復制時，跳過損傷部位，新鏈產(chǎn)生的缺口由母鏈彌補，原損傷部位并沒有切除但在后代逐漸被稀釋。應急反應和易錯修復：造成DNA損傷或抑制復制的處理均能引起一系列復雜的誘導效應,稱為應急反應(SOSresponse)。此過程誘導產(chǎn)生切除修復和重組修復中的關(guān)鍵蛋白和酶，同時產(chǎn)生無校對功能的DNA聚合酶。所以會有2種結(jié)果：修復或變異（進化）。（一）錯配修復（mismatchrepair）細菌借助半甲基化DNA而區(qū)分“舊鏈”和“新鏈”。Dam甲基化酶可使DNA的GATC序列中腺嘌呤N6位甲基化。復制后DNA在短期內(nèi)（數(shù)分鐘）保持半甲基化的GATC序列，一旦發(fā)現(xiàn)錯配堿基，即將未甲基化的一段核苷酸切除，并以甲基化鏈為模板進行修復合成。大腸桿菌真核生物的DNA錯配修復機制與原核生物相似。相鄰的胸腺嘧啶紫外線照射環(huán)丁烷胸腺嘧啶二聚體紫外線誘導嘧啶二聚體形成（二）直接修復（directrepair）

－－光復活修復光復活酶又稱光裂合酶，吸收＞300nm的光能（三）切除修復（excisionrepair）

－－暗修復將DNA分子中的受損傷部分切除，以完整的那條鏈為模板再重新合成。特異內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA連接酶均參與。（復制前修復）AP位點即無嘌呤(apurinic)或無嘧啶位點(apyrimidinicsite)（四）重組修復（recombinationrepair）復制時，跳過損傷部位，新鏈產(chǎn)生缺口由母鏈彌補，原損傷部位并沒有切除但在后代逐漸被稀釋。（復制后修復）（五）應急反應(SOS)和易錯修復(error-pronerepair)

造成DNA損傷或抑制復制的處理均能引起一系列復雜的誘導效應，稱為應急反應（SOSresponse）。

SOS誘導產(chǎn)生切除修復和重組修復中的關(guān)鍵蛋白