DB23T 3897-2024 基于60Coγ輻射技術(shù)創(chuàng)制秸稈降解真菌種質(zhì)資源篩選鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.0123CCSB0523黑 龍 江 省 地 方 標 準DB23/T3897—202460Coγ2024-12-30發(fā)布 2024-12-30實施黑龍江省市場監(jiān)督管理局??發(fā)布DB23/T3897DB23/T3897—2024II前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院、哈爾濱學(xué)院、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：胡小梅、李鳳蘭、董士嘉、李孝忠、王浩、谷春濤、高愛麗、孫以新、馮旭、高云飛、虞琦、賀付蒙、田苗。DB23/T3897DB23/T3897—2024PAGEPAGE3基于60Coγ輻射技術(shù)創(chuàng)制秸稈降解真菌種質(zhì)資源篩選鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本標準界定了基于60Coγ輻射技術(shù)創(chuàng)制秸稈降解真菌種質(zhì)資源篩選鑒定技術(shù)的術(shù)語和定義，規(guī)定了秸稈降解真菌創(chuàng)制、突變菌株篩選鑒定、秸稈降解菌株保藏和檔案管理。Cγ規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB10252 γ輻照裝置的輻射防護與安全規(guī)范GB/T17568 γ輻照裝置設(shè)計建造和使用規(guī)范GB/T23874 飼料添加劑木聚糖酶活力的測定分光光度法HJ710.11-2014 生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則大型真菌NY/T3494 農(nóng)業(yè)生物質(zhì)原料纖維素、半纖維素、木質(zhì)素測定SN/T2632 微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。秸稈降解真菌能夠?qū)⒆魑锝斩挿纸狻⒏囊活惍a(chǎn)孢絲狀真菌。秸稈降解真菌創(chuàng)制菌種來源從自然環(huán)境中分離的具有降解秸稈能力的真菌，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)方法培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基馬鈴薯浸出粉12g，葡萄糖20g，瓊脂15g，去離子水定容至1000mL，121℃滅菌20min。高粱粒培養(yǎng)基高粱粒5g，去離子水5mL，121℃滅菌20min。產(chǎn)酶培養(yǎng)基（MA）十二水磷酸氫二鈉17.907g，硫酸銨1.4g，磷酸二氫鉀2.0g，七水硫酸鎂0.60g，氯化鈣0.60g，尿素0.3g，失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚0.5mL，蛋白胨2.0g，微量元素溶液1mL，pH5.5，去離子水定容至1000mL。微量元素溶液七水硫酸亞鐵0.5g，一水硫酸錳0.16g，七水硫酸鋅0.14g，六水合二氯化鈷0.2g，去離子水定容至100mL，0.22μm無菌濾膜過濾除菌。菌種活化將凍存的菌種解凍后在PDA培養(yǎng)基上采用四區(qū)劃線方法進行活化，長出單菌落后，備用。孢子懸浮液制備將菌種活化后長出的單菌落接種至高粱粒培養(yǎng)基中，3048h后，將產(chǎn)生的孢子用無菌6000rpm條件下離心20min稀釋1106CFUmL1108CFUmL。輻射處理輻射劑量Co的Cγ2000Gy為宜。輻射裝置CγGB/T1758輻射方法輻射方法應(yīng)符合GB10252的規(guī)定。突變菌株篩選鑒定菌株篩選篩選指標篩選指標包括菌株致死率、形態(tài)指標、纖維素酶和半纖維素酶活力、木質(zhì)素酶活力、和秸稈降解率。致死率誘變結(jié)果以致死率表示，致死率按式（1）計算：??=?????×100%··················································(1)??式中：LR—致死率；Cc—陰性對照PDA平板菌落數(shù)；CT—試驗組PDA平板菌落數(shù)。形態(tài)指標篩選將輻射誘變后符合致死率≥85%的菌株孢子懸浮液稀釋100100μL稀釋孢子液涂布在PDA平板上。在28纖維素酶和半纖維素酶活力測定內(nèi)切葡聚糖酶活力取1%（w/v）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液1.5mL，加入0.5mL稀釋后的粗酶液，50min。采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）測定法，加入1.5mLDNS顯色劑。沸水浴5min終止反應(yīng)，在540nmCMC-Na產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量定義為1U。對照組中加入沸水浴30min滅活的粗酶液，其它條件均相同，按照式（2）計算酶活力。外切葡聚糖酶活力取0.1%（w/v）對硝基苯酚纖維二糖苷（pNPC）溶液50μL，加入100μL稀釋后的粗酶液，50℃水浴條件下孵育30min。加入150μL10%Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在420nm波長下測定吸光度，三次重復(fù)實驗。根據(jù)對硝基苯酚標準曲線計算酶活力，每分鐘水解pNPC產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1U。對照組中加入沸水浴30min滅活的粗酶液，其它條件均相同，按照式（2）計算酶活力。β-葡萄糖苷酶活力取0.5mL5030minDNS測定法，加入1.5mLDNS顯色劑，沸水浴5min終止反應(yīng)，在540nm波長處測定吸光度，三次重復(fù)實驗。1μmol還原糖所需的酶量定義為1Umin滅活的粗酶液，其它條件均相同，按照式（2）計算酶活力。木聚糖酶活力按照GB/T23874

?=??

×?×1000·················································(2)式中：U—相應(yīng)纖維素或半纖維素酶活力；m—根據(jù)標準曲線方程計算出相應(yīng)葡萄糖或?qū)ο趸椒淤|(zhì)量（mg）；M—葡萄糖或?qū)ο趸椒幽栙|(zhì)量（g/mol）；t—酶解反應(yīng)時間（min）；1000—轉(zhuǎn)化因子，1mmol=1000μmol；n—樣品總稀釋倍數(shù)。木質(zhì)素酶活力測定漆酶活力取3.3mL100mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5），加入0.5mL0.5mmol/LABTS（2,2'-聯(lián)氮420-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸200μL303min，在420n（?=3600Lmol·c1molABT420錳過氧化物酶活力取2.5mL50mmo/L琥珀酸-琥珀酸鈉緩沖液（pH4.5），加入0.4mL1.6mml/LMnS4溶液，加入1mL100L10mmo/LO373mi，在240nm240（?=6500L·mol-1·cm-1）處測定吸光度變化，三次重復(fù)實驗。每分鐘氧化1μmolMn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+所需的酶量為一個酶活單位（U），按照式（3）計算酶活力。240木質(zhì)素過氧化物酶活力取2.5mL250mmol/L酒石酸-酒石酸鈉緩沖液（pH3.0），加入0.4mL10mmol/L藜蘆醇（VA），加入1mL粗酶液，加入100μL10mmol/LH2O2溶液，混勻。在30℃水浴條件下孵育3min，在310nm310（?=9300L·mol-1·cm-1）處測定吸光度變化，三次重復(fù)實驗。每分鐘氧化1μmol的藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位（U），按照式（3）計算酶活力。310?=??×總×106 (3)??? 酶式中：U—相應(yīng)木質(zhì)素酶活力；△A—t時間內(nèi)吸光度變化值；l—比色皿厚度（cm）；t—反應(yīng)時間（min）；V總—反應(yīng)體系體積（mL）；V酶—反應(yīng)中酶液的體積（mL）；?—摩爾消光數(shù)（L·mol-1·cm-1）。秸稈降解率選擇纖維素酶活力、半纖維素酶活力和木質(zhì)素酶活力高（如占前50%）的突變菌株進行秸稈降解率PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)至g秸稈放入50mL經(jīng)0.22μm的濾膜進行過濾的土壤懸浮液中，然后加入上述調(diào)整好的菌液。在152周，然后將降解后的秸稈取出放置在8048h烘干。參照NY/T3494，測定秸稈中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的含量。以第0d為對照組，均進行三次重復(fù)。木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率分別按式（4）（5）（6）計算：??=?1??2×100%·················································(4)?2??=?3??4×100%·················································(5)?3??=?5??6×100%·················································(6)?5式中：LD—木質(zhì)素降解率；CD—纖維素降解率；HD—半纖維素降解率；M1—對照組秸稈中木質(zhì)纖維素含量；M2—處理組秸稈中木質(zhì)纖維素含量；M3—