食品毒理學(xué) 化學(xué)毒物的生殖毒性學(xué)習(xí)課件

第七章化學(xué)毒物的生殖毒性生殖過(guò)程一般是指從配子形成直到胎兒娩出的整個(gè)過(guò)程。生殖過(guò)程是很廣泛的，它包括精子的發(fā)生、卵的形成和發(fā)育、配子的釋放、受精、卵裂和胚泡發(fā)育、著床、胚胎發(fā)生、胎兒發(fā)育、分娩。而胎兒的娩出也并不意味著胎兒發(fā)育成熟的終止。從廣義上講還應(yīng)包括胎兒娩出后的新生兒期、哺乳期、直到性成熟的整個(gè)過(guò)程。生殖毒性是指外源化學(xué)物對(duì)雄性和雌性生殖功能或能力以及對(duì)后代產(chǎn)生的不良效應(yīng)。生殖毒性既可發(fā)生于生殖細(xì)胞、受精卵、胚胎形成期，也可發(fā)生于妊娠、分娩和哺乳期。表現(xiàn)為外源化學(xué)物對(duì)生殖過(guò)程的影響。例如，生殖器官及內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化，對(duì)性周期和性行為的影響，以及對(duì)生育力和妊娠結(jié)局的影響等。影響人類(lèi)生殖功能的環(huán)境因素包括各種化學(xué)物、電離和非電離輻射、物理因素、感染因素、生活方式以及藥物的應(yīng)用等。第一節(jié)雄性生殖毒性一、雄性生殖細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程睪丸由一系列高度卷曲的輸精管和具有支持功能的結(jié)締組織、淋巴細(xì)胞、脈管、吞噬細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞等組成。輸精管系統(tǒng)由兩類(lèi)不同的細(xì)胞，即精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞組成。隨著睪丸的發(fā)育成熟，精原細(xì)胞不斷增多，并由輸精管的基底膜向管腔遷移，經(jīng)減數(shù)分裂分化成精子。精子是一種高度分化的細(xì)胞，它不僅把父代的遺傳信息傳遞給卵細(xì)胞，而且又可決定新生后代的性別。精子的發(fā)生過(guò)程是指精原細(xì)胞發(fā)育成為成熟精子的過(guò)程。精子發(fā)生過(guò)程始于胎兒期的原始生殖細(xì)胞。出生后，原始生殖細(xì)胞分化成精原細(xì)胞，后者直至青春期以前在曲細(xì)精管中處于休止?fàn)顟B(tài)。在青春期，在腦垂體促性腺激素的作用下，開(kāi)始增值，進(jìn)行有絲分裂，形成兩個(gè)單倍體的次級(jí)精母細(xì)胞，再經(jīng)第二次成熟分裂，形成四個(gè)單倍體的精子細(xì)胞，精子細(xì)胞再經(jīng)過(guò)一系列形態(tài)學(xué)變化成為具有特殊形態(tài)的成熟精子。隨后由間質(zhì)細(xì)胞包裹釋放入輸精管內(nèi)，移入附睪后進(jìn)一步成熟，成為具有受精能力和活動(dòng)力的精子，進(jìn)入精囊并在此貯存。精子生成是一連續(xù)發(fā)生過(guò)程，從一個(gè)精原細(xì)胞分化成為成熟的精子，在不同的物種和品系中所需要的時(shí)間并不相同，如人類(lèi)需要64d、小鼠35d、兔43d，wistar大鼠53.2d、公牛54d。精子發(fā)生過(guò)程是在神經(jīng)內(nèi)分泌的精密調(diào)控下進(jìn)行的。調(diào)節(jié)精子發(fā)生的激素主要有垂體前葉分泌的卵泡刺激素（FSH）、黃體生成激素（m）以及睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的雄激素。黃體生成激素可刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育，使其分泌雄性激素，主要是睪丸酮。雄激素可能促進(jìn)精細(xì)胞的增值與分化及維持性功能。而卵泡刺激素可促進(jìn)睪丸內(nèi)精子的發(fā)生。精子發(fā)生存在周期性變化，它受到神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控。對(duì)于同一種動(dòng)物而言，精子發(fā)生所需要的時(shí)間相對(duì)恒定。了解生精上皮的周期性變化，對(duì)確定環(huán)境因素特別是化學(xué)毒物對(duì)精子發(fā)育各階段的影響有重要意義。外源化學(xué)物作用時(shí)間與精子發(fā)育階段的關(guān)系見(jiàn)表7一1。二、外源化學(xué)物的雄性生殖毒性睪丸的功能主要是生成精子和合成雄激素。精子的生成有賴(lài)于丘腦下部一垂體一睪丸軸的調(diào)節(jié)功能。外源性化學(xué)物無(wú)論是直接影響睪丸的功能或間接影響丘腦下部一垂體一睪丸軸的調(diào)節(jié)功能，均表現(xiàn)為生殖系統(tǒng)受損。（一）對(duì)睪丸生精細(xì)胞的影響棉酚是影響睪丸功能的典型外源性化學(xué)物，是存在于棉子中的一種黃色酚類(lèi)色素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)長(zhǎng)期食用粗制棉子油，組織學(xué)觀(guān)察中可發(fā)現(xiàn)睪丸的生精上皮丟失，而其它器官無(wú)病理變化。通過(guò)電子顯微鏡觀(guān)察，可見(jiàn)睪丸內(nèi)精子、精細(xì)胞和精母細(xì)胞受損，對(duì)精子影響的主要表現(xiàn)是精子細(xì)胞的頂體（acrosome）腫脹、分離與碎裂，精子中段的線(xiàn)粒體螺旋鞘排列紊亂，嵴目減少。棉酚還可直接作用于精子，使其活力受到抑制，其機(jī)理可能為葡萄糖與果糖代謝障礙?，F(xiàn)已證實(shí)棉酚的毒作用部位是睪丸，它作用于精子發(fā)育過(guò)程的不同階段，最終表現(xiàn)為精子減少、不育。重要的工業(yè)污染物二硫化碳（CS2）早在1860年就已被發(fā)現(xiàn)可引起睪丸萎縮。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)CS2對(duì)多種動(dòng)物睪丸有損害作用。表現(xiàn)為睪丸明顯萎縮，精子生產(chǎn)障礙。鉛、錫、汞、錳等重金屬，均具有不同程度的生殖毒性。鉛可通過(guò)血一睪屏障，對(duì)睪丸的形態(tài)和功能造成損害。具體表現(xiàn)為精液中畸形精子增多，正常精子數(shù)目和活動(dòng)率下降。此外，動(dòng)物試驗(yàn)均證明，多種農(nóng)藥具有使精子生成減少、睪丸萎縮、畸形精子增多、性功能減退等雄性生殖毒性作用。（二）對(duì)內(nèi)分泌功能的影響睪丸的功能受垂體前葉分泌的促性腺激素的調(diào)節(jié)，而垂體分泌的促性腺激素又受下丘腦產(chǎn)生的促性腺釋放激素（GnRH）的調(diào)節(jié)。促性腺激素包括卵泡刺激素（FSH）和黃體生成激素（LH）。FSH能促進(jìn)睪丸內(nèi)精子的發(fā)生和精子的成熟。LH能刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育并分泌雄激素。精子的生成是在神經(jīng)內(nèi)分泌的精密調(diào)節(jié)和控制下進(jìn)行。在血液中雄激素和促性腺激素含量達(dá)到一定水平后，引起反饋?zhàn)饔糜诖竽X皮質(zhì)、下丘腦和腺垂體，影響它們的分泌活動(dòng)，調(diào)節(jié)各級(jí)激素的產(chǎn)生，以維持動(dòng)態(tài)平衡，精子生成過(guò)程方可正常進(jìn)行。如果上述的任何一環(huán)節(jié)受到環(huán)境因素特別是化學(xué)毒物的作用，不僅影響其功能的發(fā)揮，更重要的是影響精子的生成。已證實(shí)，重金屬鉛可干擾下丘腦-垂體-睪丸軸的正常功能，主要是影響GnRH的釋放，表現(xiàn)為FSH、LH、睪酮含量降低。據(jù)報(bào)道，對(duì)鉛作業(yè)工人性激素含量進(jìn)行研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)血清中FSH、LH、睪酮含量的平均值明顯低于對(duì)照組，三種激素與血鉛含量有明顯的劑量－反應(yīng)關(guān)系，呈負(fù)相關(guān)。并造成鉛作業(yè)工人睪丸內(nèi)精子發(fā)生和成熟受阻，精子數(shù)目減少，活動(dòng)能力減弱，又由于睪酮含量減少，造成陽(yáng)痿和性欲減退者增多。此外，對(duì)CS2作業(yè)男性工人性激素含量檢查結(jié)果表明，血中睪酮含量顯著低于對(duì)照組，而血清中FSH和LH含量均顯著高于對(duì)照組，并與血中睪酮水平的降低呈明顯相關(guān)，表現(xiàn)為睪丸明顯萎縮、精子生成障礙和性欲降低。（三）對(duì)性功能和生殖功能的影響雄性機(jī)體性功能包括性欲、陰莖勃起、性交、情欲高潮和射精等幾個(gè)方面。整個(gè)過(guò)程由一系列復(fù)雜的條件反射和非條件反射構(gòu)成。維持雄性正常性活動(dòng)的基礎(chǔ)是正常的雄性生殖器官、正常的內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的生理、生化反應(yīng)以及正常的精神心理狀態(tài)。繁殖是雌、雄雙方共同完成的過(guò)程。雄性發(fā)育應(yīng)具備的基本條件為：具有正常的內(nèi)分泌系統(tǒng)，即下丘腦一垂體一睪丸軸的功能正常；精子的生成、成熟、貯存及輸出，即有正常的睪丸、附睪、輸精管、射精管和尿道；外生殖器和附屬性腺正常。環(huán)境因素特別是外源化學(xué)物（化學(xué)毒物）如果造成上述任何一個(gè)環(huán)節(jié)的異常，則表現(xiàn)出雄性不育，即造成雄性生殖功能障礙。對(duì)性功能和生殖功能影響較大的外源化學(xué)物不僅有鉛、錫、汞、錳等重金屬，而且已證明環(huán)境因素等均對(duì)性功能和生殖功能有明顯的不良影響。三、雄性生殖毒性的檢測(cè)方法觀(guān)察外源化學(xué)物對(duì)生殖過(guò)程各個(gè)階段可能出現(xiàn)的損害作用，在毒理學(xué)中常用大鼠和小鼠作為研究對(duì)象。（一）精子生成分析精子生成分析是研究雄性生殖毒性中最簡(jiǎn)單的試驗(yàn)方法。收集精子的方法可采用交配射精后沖洗陰道的方式獲取精子，但大多數(shù)采用處死動(dòng)物收集附睪尾部和輸卵管中的精子。可通過(guò)下列指標(biāo)對(duì)精子生成情況做出評(píng)定。(1)精子計(jì)數(shù)精子數(shù)是雄性性功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，可提供有關(guān)精子發(fā)育與成熟方面的粗略信息。如果精子數(shù)目顯著減少，則可以認(rèn)為受試外源化學(xué)物對(duì)雄性生殖具有損害作用，但不能確定毒性作用發(fā)生在精子生成周期的哪個(gè)環(huán)節(jié)。(2)精子形態(tài)觀(guān)察精子的形態(tài)通過(guò)伊紅染色在顯微鏡下很容易觀(guān)察。精子頭部和尾部的形態(tài)學(xué)改變可影響精子運(yùn)動(dòng)和穿透卵細(xì)胞的能力。但此項(xiàng)指標(biāo)不夠靈敏，應(yīng)結(jié)合其它試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。(3)精子狀態(tài)分析試驗(yàn)包括精液的pH、液化時(shí)間，精子運(yùn)動(dòng)能力，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和微量元素的含量等。通過(guò)此項(xiàng)試驗(yàn)，可了解精子所處的微環(huán)境及精子運(yùn)動(dòng)等情況是否與外源化學(xué)物有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果需結(jié)合其它試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。（二）精子穿透試驗(yàn)精子穿透試驗(yàn)實(shí)際上就是精子體外受精的實(shí)驗(yàn)，是檢測(cè)精子在體外能否成功地穿透去透明帶的金黃地鼠卵子而受精的試驗(yàn)，精子在體外成功地穿透卵子的能力是常規(guī)精子分析所不能顯示的?？勺鳛槌Ｒ?guī)精液分析的輔助指標(biāo)。不僅可做大鼠、小鼠、兔、豬及牛的精子，而且可做人的精子。此項(xiàng)試驗(yàn)方法，為綜合評(píng)價(jià)外源化學(xué)物對(duì)人類(lèi)精子受精能力的影響、探明雄性不育，提供了科學(xué)依據(jù)?？捎糜诓挥Y和外源化學(xué)物生殖毒性方面的檢測(cè)。（三）睪丸中標(biāo)志酶活性的測(cè)定睪丸作為靶器官，在形態(tài)學(xué)尚無(wú)明顯改變時(shí)，睪丸的標(biāo)志酶活性就可能已受到影響。通過(guò)睪丸中標(biāo)志酶活性的測(cè)定，就可以簡(jiǎn)便且可靠地反映出外源化學(xué)物對(duì)睪丸功能的損害。此種酶的活力的變化可作為早期損害的指標(biāo)。已知睪丸中的酶大致可分為兩類(lèi)，一類(lèi)為透明質(zhì)酸酶、山梨醇脫氫酶(SDH)，乳酸脫氫酶同工酶x(LDH-x)，5-核苷酸酶、α-磷酸甘油脫氫酶等，在精母細(xì)胞和精細(xì)胞中首先出現(xiàn)，其含量和活性隨精子的形成、成熟而達(dá)到高峰。另一類(lèi)為6-磷酸葡萄糖脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、三磷酸甘油醛脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿苷二磷酸酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等，在睪丸足細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞或精原細(xì)胞內(nèi)含量最高，其含量和活性在性成熟前達(dá)到高峰，并隨精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子的形成、成熟而降低。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常檢測(cè)乳酸脫氫酶x(LDH-x)、山梨醇脫氫酶，6一磷酸葡萄糖脫氫酶的變化，并結(jié)合精子生成過(guò)程中各階段細(xì)胞的功能和形態(tài)學(xué)改變，即可評(píng)價(jià)外源性化學(xué)物的生殖毒性，并有可能探明其毒性作用部位和機(jī)理。（四）體外試驗(yàn)雖然整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)耗時(shí)、費(fèi)力，不能滿(mǎn)足一大批受試物檢測(cè)的要求，而且在中毒機(jī)制的研究中也受到諸多限制。因此出現(xiàn)了體外試驗(yàn)或離體實(shí)驗(yàn)以替代整體動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)方法。體外試驗(yàn)主要是將哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并與受試外源化學(xué)物接觸，觀(guān)察生殖細(xì)胞的變化。睪丸組織中除生殖細(xì)胞外，還有支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。支持細(xì)胞是睪丸生殖上皮中唯一非生殖細(xì)胞，對(duì)精子的發(fā)生具有十分重要的意義。支持細(xì)胞能分泌多種生物活性物質(zhì)，對(duì)各級(jí)生殖細(xì)胞起到營(yíng)養(yǎng)、支持和保護(hù)作用。因?yàn)樯?xì)胞本身不能利用葡萄糖，它所需的能量必須由支持細(xì)胞糖酵解所產(chǎn)生的乳酸和丙酮酸來(lái)提供。支持細(xì)胞具有較強(qiáng)的糖酵解能力，可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸和丙酮酸。間質(zhì)細(xì)胞分布在睪丸曲細(xì)精管的結(jié)締組織中，細(xì)胞呈圓形、梭形或多角形，體積較大，胞核有1－2個(gè)核仁，呈嗜酸性，含有滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。間質(zhì)細(xì)胞通過(guò)合成和分泌雄激素保證生精過(guò)程的正常進(jìn)行以及雄性器官和性行為的發(fā)育和維持。通過(guò)支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等體外分離培養(yǎng)，測(cè)定支持細(xì)胞的乳酸含量和乳酸脫氫酶活性的變化以及測(cè)定間質(zhì)細(xì)胞分泌的雄激素含量來(lái)判斷外源化學(xué)物是否對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞的功能有影響。另外，對(duì)分離培養(yǎng)的支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，亦可通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)檢查的方法來(lái)判斷外源化學(xué)物是否對(duì)支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞有損害作用。若細(xì)胞受到損害，則表現(xiàn)出固縮、脫壁、死亡及崩解。（五）雄性激素檢測(cè)睪丸在生成精子的同時(shí)還具有分泌性激素的功能。雄性激素是睪丸中產(chǎn)生的主要性激素，睪丸的功能主要靠FSH、LH和雄激素（主要為睪酮）來(lái)維持和調(diào)節(jié)。FSH主要作用于曲細(xì)精管的支持細(xì)胞，使其合成與分泌雄性激素結(jié)合蛋白。使曲細(xì)精管中的雄性激素濃聚并達(dá)到一定水平。LH主要作用于間質(zhì)細(xì)胞，使其合成和分泌睪酮。雄性生殖系統(tǒng)無(wú)論生精過(guò)程、精子成熟過(guò)程，還是附屬性腺的分泌活動(dòng)，都需要有足夠的睪酮（屬類(lèi)固醇激素），通過(guò)檢測(cè)上述三種性激素的含量變化來(lái)判斷外源性化學(xué)物是否對(duì)雄性生殖產(chǎn)生影響。檢測(cè)上述三種性激素含量有助于生殖毒性的評(píng)價(jià)以及生殖毒作用機(jī)制的探討。（六）顯性致死試驗(yàn)顯性致死試驗(yàn)是通過(guò)給予雄性動(dòng)物受試化學(xué)物，將其與未經(jīng)受試物處理的雌性動(dòng)物交配，觀(guān)察雌性動(dòng)物早期胚胎死亡情況，以評(píng)價(jià)受試物是否對(duì)雄性動(dòng)物的生殖有損害作用的試驗(yàn)。哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞，受到損傷發(fā)生突變后，往往不能與異性細(xì)胞結(jié)合，即失去結(jié)成合子的能力。例如，雄性生殖細(xì)胞不能使卵細(xì)胞受精，或使受精卵在著床前死亡，也能使著床后的受精卵不能成活以至胚胎早期死亡。由于此種損害在F1代即可表現(xiàn)，故稱(chēng)為“顯性”。試驗(yàn)觀(guān)察指標(biāo)為早期胚胎死亡，故稱(chēng)為顯性致死試驗(yàn)。通過(guò)顯性致死試驗(yàn)可以評(píng)定受試物對(duì)雄性動(dòng)物性功能的影響。本方法系采用哺乳動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，較接近人體實(shí)際情況，主要觀(guān)察指標(biāo)為胚胎早期死亡，即觀(guān)察子宮中活胎、死胎及吸收胎等數(shù)目，易于觀(guān)察，試驗(yàn)技術(shù)容易掌握，不需要復(fù)雜的設(shè)備條件。缺點(diǎn)是不夠靈敏，只有較大劑量，精細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，才能引起胚胎早期死亡。（七）雄性生殖細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)雄性生殖細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)方法，除小鼠睪丸染色體畸變分析試驗(yàn)、小鼠精子畸變分析試驗(yàn)、黑腹果蠅染色體伴性隱性分析試驗(yàn)等傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)外，這里再介紹一下近年在遺傳毒理學(xué)研究中廣泛被采用的新方法—單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)。單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)是1984年由Ostiling和Johanson首先建立并應(yīng)用于遺傳毒性試驗(yàn)的，該方法具有能簡(jiǎn)便而又快速測(cè)試完整細(xì)胞DNA鏈斷裂的優(yōu)點(diǎn)。其原理和方法為：細(xì)胞在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中受化學(xué)物作用后，DNA鏈發(fā)生斷裂。將細(xì)胞制成單細(xì)胞混懸液，在載玻片上制備加有受檢細(xì)胞混懸液的凝膠，在堿性條件下使細(xì)胞裂解，解旋DNA后進(jìn)行電泳。帶負(fù)電荷的DNA斷裂端由陰極向陽(yáng)極遷移。DNA經(jīng)EB染色（溴化乙錠）后在熒光顯微鏡下可觀(guān)察到DNA受損的細(xì)胞核拖一條尾巴，呈彗星狀，如DNA無(wú)損傷則見(jiàn)圓形的核。故單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)又稱(chēng)彗星試驗(yàn)。觀(guān)察時(shí)通過(guò)自動(dòng)圖像分析儀測(cè)定呈彗星狀細(xì)胞的數(shù)量和比例并計(jì)算出受損的DNA量，或通過(guò)手工操作的方法用目鏡測(cè)微尺在熒光顯微鏡下測(cè)量細(xì)胞核的直徑和彗星尾部的長(zhǎng)度，以此作為DNA受外源化學(xué)物損傷的評(píng)價(jià)指標(biāo)。（八）雄性生殖毒性病理檢查睪丸、附睪、前列腺以及精囊的重量和大小的改變常是接觸有害外源化學(xué)物的明顯征兆。睪丸組織易受到外來(lái)化學(xué)毒物的侵害，因此在亞慢性或慢性動(dòng)物毒性試驗(yàn)中，睪丸組織形態(tài)檢查是一項(xiàng)重要的觀(guān)察指標(biāo)。外來(lái)外源化學(xué)物作用于雄性生殖系統(tǒng)，可引起睪丸及其附屬器官、組織或細(xì)胞的病理性損傷。睪丸各種細(xì)胞，特別是各級(jí)生精細(xì)胞的生理、生化功能各異，因而毒作用引發(fā)的受損表現(xiàn)與程度亦有很大差異。動(dòng)物試驗(yàn)表明，不同化學(xué)毒物對(duì)睪丸曲細(xì)精管生精上皮的發(fā)育有不同程度的影響，有些化學(xué)毒物可引起生精細(xì)胞胞質(zhì)、胞核的改變，甚至引起細(xì)胞產(chǎn)生變性、壞死；有些化學(xué)毒物可引起精子數(shù)目減少。解剖觀(guān)察是生殖毒性病理檢驗(yàn)的主要環(huán)節(jié)，對(duì)以后的光鏡或電鏡觀(guān)察結(jié)果的可靠性以及結(jié)論的正確性都有很大的影響，必須認(rèn)真做好大體解剖的操作、檢視和記錄，正確取材，選擇合適的固定液保存病理檢驗(yàn)材料，為病理檢驗(yàn)的正確性提供前提條件。某種意義上而言，從解剖、病理學(xué)觀(guān)察等形態(tài)學(xué)角度評(píng)價(jià)外來(lái)外源化學(xué)物對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用，是雄性生殖毒理學(xué)研究中不可缺少的較為敏感的指標(biāo)和重要手段。第二節(jié)雌性生殖毒性一、雌性生殖細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程雌性生殖系統(tǒng)由卵巢、輸卵管、子宮和外生殖器等組成。卵巢產(chǎn)生生殖細(xì)胞（即卵細(xì)胞）和分泌性激素，輸卵管是輸送卵細(xì)胞和卵受精之處，子宮是孕育胎兒的器官。卵巢由正在生長(zhǎng)的卵泡（包括卵細(xì)胞、包裹的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞）和支持細(xì)胞組成。卵泡的發(fā)育是一個(gè)連續(xù)變化的過(guò)程，一般可分為原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和成熟卵泡四個(gè)階段。在雌性胎兒卵巢內(nèi)，最初為卵原細(xì)胞，聚集在卵巢皮質(zhì)，經(jīng)有絲分裂增殖與分化發(fā)育為初級(jí)卵母細(xì)胞，出生后，停止分裂活動(dòng)直至青春期。女?huà)氤錾鷷r(shí)卵巢中有10萬(wàn)～200萬(wàn)個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞，至青春期，排卵前，初級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)行第一次減數(shù)分裂形成次級(jí)卵母細(xì)胞和第一極體，而后次級(jí)卵母細(xì)胞迅速進(jìn)行第二次減數(shù)分裂，但停留在分裂中期直到受精，精子進(jìn)入卵細(xì)胞后第二次分裂才完成。卵巢的周期性變化與動(dòng)情周期密切相關(guān)。初級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)一步成熟并發(fā)育至次級(jí)卵母細(xì)胞，需垂體下葉分泌的FSH和LH的作用，并在卵泡膜內(nèi)層細(xì)胞分泌的雌激素作用下，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生和生殖器的發(fā)育，為受孕做好準(zhǔn)備。當(dāng)卵泡接近成熟時(shí)，F(xiàn)SH、LH和雌激素分泌處于高峰，促成成熟卵泡的破裂、排卵和黃體生成。如果卵子受精成功，黃體在絨毛膜促性腺激素（HCG）的作用下繼續(xù)發(fā)育，體積變大，孕酮和雌激素分泌持續(xù)增高，抑制下丘腦和垂體前葉的分泌活動(dòng)。如果卵子未受精，黃體萎縮退化，血中雌激素和孕酮的濃度下降，表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜的脫落。同時(shí)，不再抑制下丘腦和垂體前葉的分泌活動(dòng)，又開(kāi)始分泌促性腺激素。卵巢中又有卵泡的生成，如此生長(zhǎng)反復(fù)循環(huán)，形成卵子生成的周期性變化。雌性（女性）動(dòng)物在出生后，卵細(xì)胞數(shù)目即已固定，不再形成新的初級(jí)卵母細(xì)胞。對(duì)女性而言，到青春期在垂體促性腺激素的作用下，每月有8～10個(gè)卵泡向成熟卵泡發(fā)育，但一般只有一個(gè)能發(fā)育成熟并由卵泡中排出（一個(gè)婦女一生中有300～400個(gè)卵細(xì)胞成熟）。與此相反，男性在青春期以后還能不斷地產(chǎn)生初級(jí)精母細(xì)胞，即精子的發(fā)生伴有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的細(xì)胞群復(fù)制。二、外源化學(xué)物的雌性生殖毒性雌性哺乳動(dòng)物也和雄性哺乳動(dòng)物一樣，生殖系統(tǒng)及其功能有許多組織器官參與，也涉及許多內(nèi)在和外在因素。因此，外源化學(xué)物對(duì)雌性動(dòng)物毒作用也往往表現(xiàn)有許多部位或環(huán)節(jié)。（一）對(duì)卵細(xì)胞的影響對(duì)卵細(xì)胞發(fā)育過(guò)程受化學(xué)毒物損傷的研究無(wú)論深度和廣度都不如精子的研究，主要是研究難度要大些，特別是對(duì)人的研究。懷孕后的生理變化使得婦女比處于同樣環(huán)境中同齡男子可能會(huì)吸收更多的化學(xué)毒物，因而受到的潛在危害性也會(huì)大些。無(wú)論是體細(xì)胞還是卵細(xì)胞受到損害都有可能影響其后代的健康。研究表明，卵細(xì)胞發(fā)育到排卵前階段即第一次減數(shù)分裂的終變期和中期對(duì)化學(xué)毒物最敏感。如鎘，NIH雌性小鼠皮下一次注射氯化鎘1,3,6mg/kg后，排卵能力明顯受抑制，排卵數(shù)目隨劑量增加而減少，呈明顯的劑量一反應(yīng)關(guān)系。在肉眼與光鏡下可見(jiàn)性腺發(fā)生明顯病理學(xué)改變；電鏡下中高劑量組的初級(jí)卵母細(xì)胞和次級(jí)卵母細(xì)胞出現(xiàn)明顯病理學(xué)變化，可見(jiàn)到細(xì)胞核核膜嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，核基質(zhì)電子密度增加，核仁凝聚成團(tuán)，胞漿線(xiàn)粒體腫脹，高爾基復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張與腫脹，同時(shí)發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常等現(xiàn)象。根據(jù)放射免疫分析和卵巢鎘含量測(cè)定結(jié)果提示，鎘可能直接進(jìn)入到卵母細(xì)胞內(nèi)并損傷其遺傳物質(zhì)。鎘與金屬硫蛋白中的Zn2+相互作用，干擾器官中鋅的動(dòng)力學(xué)平衡和DNA合成的聚合酶（含鋅），從而導(dǎo)致次級(jí)卵母細(xì)胞染色體數(shù)目異常。另外，鎘還可能與形成細(xì)胞分裂時(shí)的紡錘體的含巰基蛋白質(zhì)相互作用而干擾染色體的分離過(guò)程。二硫化碳（CS2）不僅對(duì)多種動(dòng)物的睪丸有毒性作用，而且對(duì)雌性動(dòng)物性腺、胚胎也有損害作用，可影響卵巢，使動(dòng)物的動(dòng)情周期發(fā)生改變，受孕能力降低，影響受精卵和胚胎的正常發(fā)育。動(dòng)物研究表明，多次由靜脈給予雌狗CS2，總劑量達(dá)20.5mL時(shí)，可觀(guān)察到卵巢萎縮、原始細(xì)胞數(shù)減少、原始細(xì)胞和濾泡變性等損害作用。對(duì)雌性大鼠也可觀(guān)察到卵巢萎縮、動(dòng)情周期延長(zhǎng)、卵泡上皮營(yíng)養(yǎng)障礙性變化、腫脹、局部萎縮、細(xì)胞核失去明顯的邊緣等現(xiàn)象。近年的研究還發(fā)現(xiàn)，CS2可引起大鼠卵母細(xì)胞染色體畸變，可能是影響受精卵和胚胎的原因之一。雙環(huán)氧－4－乙烯環(huán)己烯等工業(yè)污染物可使成年鼠和幼年鼠原始濾泡中卵母細(xì)胞數(shù)分別減少33%和10%。環(huán)磷酰胺、胺草靈、克菌丹等均不同程度地引起雌性生殖細(xì)胞染色體畸變。多氯聯(lián)苯能降低小鼠下一代卵子受精能力與胚的著床率。此外，某些物理因素如電離輻射、放射線(xiàn)激光等，對(duì)雌性生殖細(xì)胞有致突變作用，小劑量能引起基因突變，大劑量能引起染色體畸變。（二）對(duì)內(nèi)分泌功能的影響卵巢的功能和生殖周期受體內(nèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，即通過(guò)下丘腦一垂體一性腺軸。外源化學(xué)物可影響上述任何一個(gè)環(huán)節(jié)而對(duì)雌性生殖產(chǎn)生損害作用。大量的人群調(diào)查和動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，苯及其同系物在一定劑量下會(huì)造成女性或雌性動(dòng)物的生殖功能損害，造成月經(jīng)異常、絕經(jīng)期明顯改變、生殖細(xì)胞突變，從而引起生育異常及后代的遺傳性疾病等嚴(yán)重后果。發(fā)病機(jī)理可能是該類(lèi)化合物直接干擾下丘腦，作用于垂體－卵巢系統(tǒng)，使內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常，而導(dǎo)致月經(jīng)異常。絕經(jīng)期的改變是因?yàn)槁殉补δ苁艿揭种?，卵巢發(fā)生萎縮所致。此外，林丹、開(kāi)蓬等有機(jī)氯農(nóng)藥，可使雌性動(dòng)物陰道開(kāi)啟和排卵周期延遲，甚至停止排卵，以及死胎和自然流產(chǎn)等。血清中LH和催乳素降低，而FSH濃度升高，垂體和子宮的重量明顯低于對(duì)照組。（三）其它毒性作用外源化學(xué)物對(duì)雌性哺乳動(dòng)物的毒性作用不僅表現(xiàn)在對(duì)卵細(xì)胞和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)（下丘腦一垂體一性腺軸）的影響，而且也可表現(xiàn)在子代，造成畸形、死胎、功能發(fā)育不全等。各種生殖功能毒性作用在整個(gè)生命過(guò)程的不同階段都可出現(xiàn)，這充分說(shuō)明雌性生殖毒性的復(fù)雜性。三、雌性生殖毒性的檢測(cè)方法（一）體外試驗(yàn)對(duì)外源化學(xué)物在雌性生殖系統(tǒng)的作用部位、可能的作用機(jī)理以及對(duì)雌性動(dòng)物生殖功能的影響，Amann等（1982年）曾對(duì)雌性生殖毒性提出一個(gè)較為全面的試驗(yàn)方案，見(jiàn)表7一2。表7一2。如表7一2所示，在雌性生殖毒性評(píng)價(jià)中，包括多種體外試驗(yàn)方法，能說(shuō)明生殖器官多方面的功能及完整性。體外試驗(yàn)對(duì)于闡明化學(xué)毒物的毒性作用機(jī)理具有重要意義。但目前尚不能完全替代整體動(dòng)物試驗(yàn)，例如一代繁殖試驗(yàn)、多代繁殖試驗(yàn)等。（二）動(dòng)物試驗(yàn)雌性動(dòng)物是繁殖后代過(guò)程中的主體，卵子的發(fā)生、卵細(xì)胞受精、著床、胚胎形成、胚胎發(fā)育、器官形成、胎仔發(fā)育、分娩和授乳等過(guò)程皆在雌性動(dòng)物體內(nèi)完成。在上述過(guò)程中，外源化學(xué)物可影響其中某一個(gè)或幾個(gè)環(huán)節(jié)，并導(dǎo)致對(duì)母體或后代的不良影響。在毒理學(xué)領(lǐng)域中，生殖與發(fā)育毒性的確切評(píng)定較為困難。原因在于：①在許多不同的生殖與發(fā)育階段都可以誘發(fā)損害作用；②損害作用的后果多種多樣，可以是結(jié)構(gòu)損傷或者功能損傷，并可表現(xiàn)在不同的器官等；③損害作用可表現(xiàn)在初生時(shí)期或發(fā)育成熟以后，即可表現(xiàn)在整個(gè)生命過(guò)程的不同階段。整體動(dòng)物試驗(yàn)常用的方法有兩類(lèi)：一類(lèi)為一代繁殖試驗(yàn)或多代繁殖試驗(yàn)和致畸試驗(yàn)；另一類(lèi)為三段生殖試驗(yàn)，分別在三個(gè)不同階段給予受試物，即妊娠前期及初期、器官形成期、圍產(chǎn)期及授乳期。三段生殖試驗(yàn)的第一、二階段與傳統(tǒng)的繁殖試驗(yàn)和傳統(tǒng)的致畸試驗(yàn)基本相似，第三階段是觀(guān)察外源化學(xué)物對(duì)胎兒出生后發(fā)育的影響。（三）其它輔助試驗(yàn)雌性生殖毒性的檢驗(yàn)方法，除上述體外試驗(yàn)和整體動(dòng)物試驗(yàn)外，還可進(jìn)行雌性動(dòng)物動(dòng)情周期觀(guān)察、排卵觀(guān)察、雌激素水平的測(cè)定、病理組織學(xué)測(cè)定等一些輔助試驗(yàn)。這些試驗(yàn)不僅可對(duì)雌性生殖毒性做出估計(jì)，而且對(duì)中毒機(jī)制的探討具有重要意義。第三節(jié)致畸試驗(yàn)?zāi)芤鹑焉锏娜嘶蛟囼?yàn)動(dòng)物產(chǎn)生畸胎的外源化學(xué)物稱(chēng)為致畸物。它通過(guò)胎盤(pán)直接作用于發(fā)育的胚胎和胎兒而產(chǎn)生后果。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)和體外致畸試驗(yàn)方法，可檢測(cè)外源化學(xué)物能否引起胚胎毒性或后代畸形。一、動(dòng)物致畸試驗(yàn)（一）基本原理致畸試驗(yàn)是檢查受試外源化學(xué)物能否通過(guò)妊娠母體引起胚胎毒性或后代畸形的動(dòng)物試驗(yàn)。通過(guò)致畸試驗(yàn)可以確定一種受試物是否具有致畸作用。胚胎在器官形成期孕前三個(gè)月是胎兒各器官形成的關(guān)鍵時(shí)期孕前三個(gè)月是胎兒各器官形成的關(guān)鍵時(shí)期;腦：第4周開(kāi)始形成；眼：5-8周開(kāi)始形成；心臟：5-8周開(kāi)始形成；手腳：5-9周開(kāi)始形成；口：6-7周開(kāi)始形成；耳：第8周開(kāi)始形成；性器官：8-11周開(kāi)始形成；唇：第12周開(kāi)始形成。（二）基本方法(1)動(dòng)物選擇致畸試驗(yàn)中動(dòng)物的選擇，除參照毒性試驗(yàn)中選擇動(dòng)物的一般原則，即食性和對(duì)受試物代謝過(guò)程與人類(lèi)相似、體型小、容易飼養(yǎng)和繁殖以及價(jià)廉外，還應(yīng)特別注意妊娠期較短而一致、產(chǎn)仔數(shù)多和胎盤(pán)結(jié)構(gòu)與人類(lèi)接近且自發(fā)畸形率較低等特點(diǎn)。一般選用兩種哺乳動(dòng)物，首先為大鼠，此外可采用小鼠或家兔。(2）動(dòng)物交配處理選擇健康性成熟的未曾孕產(chǎn)雌雄動(dòng)物，大鼠體重200～250g，小鼠20～25g，雌雄按1:1或2:1同籠交配。次日早晨陰道圖片檢查精子或檢查陰栓，凡發(fā)現(xiàn)檢出精子或陰栓，即確定為妊娠第0天。將查出的孕鼠按隨機(jī)分組的原則分組，大鼠或小鼠每組10～20只，家兔8～12只，狗等大動(dòng)物每組3～4只。一般多經(jīng)口給予，雌鼠妊娠的第7～15天染毒，常用灌胃方式。試驗(yàn)期間每2～3天稱(chēng)取孕鼠體重。通過(guò)體重變化可觀(guān)察受試動(dòng)物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況。受孕鼠的體重如持續(xù)增長(zhǎng)，則表示妊娠過(guò)程及胚胎發(fā)育正常；如體重停止增長(zhǎng)或下降，可能由于受試物的毒性作用或母體的其它原因，引起胚胎死亡或流產(chǎn)。(3)劑量分組致畸試驗(yàn)中劑量分組是一個(gè)極為關(guān)鍵與復(fù)雜的問(wèn)題。一般原則是一方面要求出最大無(wú)作用劑量，以及引起致畸的閾劑量，同時(shí)還要保持母體生育能力，不致母體大批流產(chǎn)和過(guò)多胚胎死亡，也應(yīng)避免較多母體死亡。一般高劑量組可選雌鼠LD50的1/5～1/3劑量，低劑量組取1/50～1/30LD50的劑量；應(yīng)最少設(shè)三個(gè)劑量組，另設(shè)對(duì)照組。最高劑量組要求為可以引起母體輕度中毒，即進(jìn)食少，體重減輕，死亡不超過(guò)10%；最低劑量組不應(yīng)觀(guān)察到任何中毒癥狀；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些較輕的中毒癥狀，其劑量與高、低劑量呈等比關(guān)系。在高、低劑量之間再插入一個(gè)中間劑量組。對(duì)照組包括陰性對(duì)照（溶劑對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照。常用的陽(yáng)性對(duì)照物有維生素A(15000IU/kg)，此外，也可用乙酰水楊酸(250mg/kg)、敵枯雙、五氯酚鈉等作為陽(yáng)性對(duì)照物。(4）動(dòng)物剖檢鼠類(lèi)有食畸形胎仔的習(xí)性，應(yīng)在預(yù)期分娩前1～2d處死母鼠進(jìn)行檢查。一般大鼠在受孕后第19～20d，小鼠第18～19d。剖檢前稱(chēng)量并記錄母鼠最終體重。常采用頸椎脫臼法或斷頭處死法處死動(dòng)物。從腹中線(xiàn)剖腹，暴露子宮和卵巢，為胎仔檢查做準(zhǔn)備。(5)胎仔檢查切開(kāi)左右兩側(cè)子宮鑒別并記錄每窩胎仔中活胎數(shù)、晚期死胎數(shù)、早期死胎數(shù)、吸收胎數(shù)及各種胎仔的特征，并記錄編號(hào)。對(duì)活胎仔要測(cè)量其體重、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)和性別。對(duì)大鼠還應(yīng)取出卵巢、記錄黃體數(shù)。然后進(jìn)行胎仔外觀(guān)畸形檢查、內(nèi)臟及軟組織畸形檢查和骨骼畸形檢查?；螜z查只限于活產(chǎn)胎仔。內(nèi)臟檢查的胎仔需在鮑音氏(Bouin)溶液中固定2周以上，用自來(lái)水沖洗固定液后，方可用切片法檢查內(nèi)臟。而骨骼畸形檢查則需經(jīng)固定、透明和茜素紅（alizarimred)染色等步驟后，才能進(jìn)行。（三）結(jié)果判定方法在致畸試驗(yàn)結(jié)果評(píng)定時(shí)，主要計(jì)算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。在計(jì)算畸胎總數(shù)時(shí)，每一活胎仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形均作為一個(gè)畸胎。在計(jì)算畸形總數(shù)時(shí)，同一胎仔出現(xiàn)一種畸形作為一個(gè)畸形計(jì)算，出現(xiàn)兩種或兩個(gè)畸形，則作為兩個(gè)畸形計(jì)算，依此類(lèi)推。常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)有：見(jiàn)幻燈二、體外致畸作用試驗(yàn)法傳統(tǒng)的動(dòng)物整體致畸試驗(yàn)需要大量試驗(yàn)動(dòng)物，耗費(fèi)大量人力物力和財(cái)力，且時(shí)間亦較長(zhǎng)，而且不適于探討致畸作用的機(jī)制，從而應(yīng)用短期的體外致畸試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)外源化學(xué)物