體外皮膚吸收試驗

體外皮膚吸收試驗SkinAbsorption：InvitroMethod1范圍本文件規(guī)定了體外皮膚吸收試驗的基本要求和方法。本試驗方法適用于單一成分的化妝品原料。2試驗目的預測和評價化妝品原料在離體皮膚中的經(jīng)皮吸收率。3定義3.1受試物testsubstances被測試的化妝品原料，為單一化學物質(zhì)。3.2未吸收量unabsorbeddose暴露后從皮膚表面洗掉的受試物，以及非遮擋性遮蓋物上存在的受試物，包括暴露期間從皮膚上揮發(fā)出來受試物的總量。3.3吸收量absorbeddose在一定時間內(nèi)到達皮膚和接收液的受試物的量。4試驗原理在特定條件下，將受試物（可以是放射標記物）暴露于擴散池中的皮膚表面一定時間后，采用適當?shù)那逑闯绦蚝头椒ǔテつw表面的受試物；并在整個試驗過程中，設置不同的時間點采集接收液，采用適當?shù)姆椒y試受試物或其代謝產(chǎn)物的物質(zhì)的量。當受試物具有代謝活性時，可以采用適當?shù)姆椒▉矸治銎浯x活性產(chǎn)物。也可以在試驗結(jié)束后，采用適當?shù)姆椒y定受試物及其代謝產(chǎn)物的分布情況。在本標準和指導性文件所描述的條件下，采用接收液和受試皮膚中的受試物的量來監(jiān)測給定時間內(nèi)受試物的吸收情況。同時應測定從皮膚表面沖洗下來的和留在皮膚里的受試物，包括分布和回收率。殘留在皮膚角質(zhì)層中的受試物可能會被吸收。一般試驗周期為24h，角質(zhì)層的殘留量不會顯著影響物質(zhì)的系統(tǒng)暴露量，通常不計入安全評估參數(shù)皮膚吸收率的計算。5試驗方法5.1擴散池擴散池由供給室和接收室組成（圖1為典型擴散池樣例），離體皮膚放置于兩者之間，其與擴散池之間應有良好的密封性，能較好控制擴散池及其內(nèi)容物的溫度，并保證與皮膚接觸的接收液的混合良好和取樣方便；靜態(tài)式或流通池式擴散池均可使用。正常情況下，供給室在暴露于有限劑量受試物過程中保持開放，但在無限劑量和部分有限劑量的情況下，供給室可以封閉。5.2接收液接收液應優(yōu)先選擇有益于生理的溶液，需提供接收液的精確組分，并證實受試物在接收液中能充分溶解，不影響皮膚吸收。另外，接收液不能影響皮膚的完整性。在循環(huán)流動系統(tǒng)中，流速不能妨礙受試物擴散進入接收液。在靜態(tài)滲透式系統(tǒng)中，接收液應連續(xù)攪拌并有規(guī)律取樣。如果要研究受試物在皮膚中的代謝效應，整個試驗過程中接收液必須能維持皮膚的活性。5.3皮膚制備皮膚來源可為人類或動物，須符合我國相關(guān)倫理要求，首選活體皮膚。非活性皮膚，如采用表皮層（酶、熱或化學分離的）或用植皮刀分離的皮膚，應避免使用太厚的皮膚（約小于1mm），證明其皮膚屏障完整性后可使用。同時還應確定皮膚種類、解剖位置以及制備技術(shù)。動物皮膚來源首選小型豬。每個受試物至少進行4次重復試驗。5.4皮膚完整性應正確制備和儲存皮膚標本，使用前檢查皮膚及其屏障的完整性。需要研究受試物在皮膚的代謝作用時，應使用新鮮皮膚，并在確保其實驗過程中的代謝活性。一般新鮮的離體皮膚應在24h內(nèi)使用，也可證明合理可行的情況下，根據(jù)代謝酶系統(tǒng)和貯藏溫度的不同而適當調(diào)整。5.5受試物制備受試物可以放射性標記或采用其他定量方法。受試樣品的制備盡可能與實際使用的狀態(tài)保持一致，偏離使用情況的制備應做合理說明。5.6受試物濃度和組成通常將受試物配制成系列濃度，其濃度范圍應覆蓋人體實際接觸的可能暴露范圍。受試物配制過程中需確保其穩(wěn)定性和均一性，對于固體、半固體制劑和混懸液，需驗證其中受試物的均一性。5.7皮膚暴露根據(jù)人體可能接觸受試物的情況，一般選擇有限劑量暴露。劑量應模仿人體暴露量，通常固體受試物為2mg/cm2~5mg/cm2，液體受試物為10μL/cm2。如有偏差，需根據(jù)預期的上樣條件、研究目標或試驗準備的物理特性進行解釋。如實驗設計為無限劑量暴露時，則不需遵循上述劑量要求。5.8溫度受試物皮膚吸收一般屬于被動吸收，其受溫度的影響較大，因此實驗時擴散室和皮膚應保持恒定接近于皮膚正常溫度（32℃±1℃）。不同的擴散池可根據(jù)自身情況調(diào)整水浴或干加熱到一定溫度，以確保離體皮膚溫度在其正常生理標準。實驗室相對濕度保持在30%~70％之間。5.9暴露時間和取樣一般情況下安全評估僅做24h暴露，皮膚完整性超過24h就會變差，因此采樣時間一般不建議超過24h。但在特殊情況下也可采用更短的暴露時間，如滲透迅速的或?qū)嶋H使用時間非常短暫的受試物。若需要了解受試物透過行為，應根據(jù)受試物的吸收特性確定接收液的采樣點。接收液的采樣點應滿足能夠以作圖形式表現(xiàn)被試物的透皮吸收情況。實際采樣頻率需基于試驗前信息（如受試物理化性質(zhì)等），試驗周期內(nèi)通常需要6個~12個采樣點。5.10樣品分析對試驗系統(tǒng)的所有組成部分均應進行分析測定，并確定回收率。其中包括供給室、皮膚表面、皮膚中、接收液/池中的所有受試物。試驗應得到足夠的回收率，放射性標記試驗的回收率應為100%±10%，其他定量方法建議回收率應為100%±15%，若偏離應合理解釋，必要時重新進行試驗。6數(shù)據(jù)處理和計算應列出接收液的分析結(jié)果，不同時間內(nèi)受試物在試驗系統(tǒng)中的分布和吸收情況。對于有限暴露劑量，應計算從皮膚清洗下的受試物的量、與皮膚結(jié)合的數(shù)量（分析不同皮膚層）以及接收液中受試物的數(shù)量（比率、數(shù)量與使用劑量的百分率）。經(jīng)皮吸收試驗的結(jié)果有時只能用接收液的數(shù)據(jù)表示，當受試物在試驗結(jié)束時仍殘留于皮膚內(nèi)的情況，總的吸收量要考慮是否扣除角質(zhì)層含量，并結(jié)合化合物作用位置和透過特性給出合理解釋。無限劑量暴露實驗時不做吸收百分比的計算?；厥章视嬎愎剑?）：*包含角質(zhì)層、活性表皮層、真皮層皮膚吸收率計算公式（2）：#是否去除角質(zhì)層應給予合理說明7試驗報告內(nèi)容7.1受試物：a)物理特性、理化性質(zhì)（至少包括相對分子質(zhì)量和LogPow）、純度（放射化學物純度）；b)鑒定資料（如批號）；c)在接收液中的溶解度。7.2受試物制備：a)使用制劑的組分和理由；b)均一性。7.3試驗條件a)皮膚來源和位置、制備方法、使用前的儲藏條件、所有預處理（清洗、抗生素處理等）、皮膚完整性測量、代謝狀況、使用的理由；b)擴散池的設計、接收液的組分、接收液的流速或采樣次數(shù)和規(guī)程；c)所用試驗制劑的詳細資料和劑量選擇的依據(jù)；d)受試物暴露持續(xù)時間；e)從皮膚清除試驗制劑的詳細內(nèi)容，如皮膚沖洗；f)分析皮膚的細節(jié)以及用于說明皮膚分布的分離技術(shù)；g)擴散池和儀器的清洗規(guī)程；h)檢測方法、提取技術(shù)、檢出限、受試物穩(wěn)定性以及分析方法的有效性。7.4結(jié)果：a)受試物的回收情況（皮膚加樣量=清洗液含量+皮膚中含量+接收液含量）；b)每個反應池的回收情況；c)受試物的吸收情況；d)經(jīng)皮吸收數(shù)據(jù)（一般以百分率表示，需要時可以滲透速度、滲透量表示）。7.5結(jié)果討論7.6結(jié)論

附錄一種用于體外經(jīng)皮吸收試驗的直立式擴散池示例圖

體外皮膚吸收試驗應用示例（咖啡因）注：條件不同數(shù)據(jù)會產(chǎn)生變化，本示例中的數(shù)據(jù)僅供參考。1試驗目的本次試驗根據(jù)《體外皮膚吸收試驗》文件中的基本原則，參考相關(guān)文獻中具體方法，研究咖啡因在離體豬皮膚的吸收特性，定量分析咖啡因的透皮吸收率。2受試物和皮膚類型試驗使用咖啡因（MW=194.2Dal，LogPow=-0.07，水中溶解度=21.6mg/mL25℃）作為受試物。皮膚模型：3月~4月齡巴馬小型豬背部或腹部皮膚。貯藏條件：制備后-20度凍存，10天內(nèi)使用，凍融不超過2次。3試劑和儀器3.1試劑0.9%氯化鈉（生理鹽水）、甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級）、異丙醇（色譜級）、磷酸（色譜級）3.2儀器與用具透皮吸收擴散儀、高效液相色譜儀、色譜柱、體式顯微鏡、經(jīng)皮水分流失測定儀、磁力攪拌器、渦旋混勻器、臺式高速冷凍離心機、真空離心濃縮儀、氮吹濃縮儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、離心管、2mL進樣瓶、移液器、槍頭、0.45/0.22μm尼龍濾膜、皮膚膠帶、刀片、取皮刀、外科剪刀、2mL注射器、吸水紙、棉簽4試驗方法4.1試驗裝置透皮吸收擴散儀，配備有Franz擴散池，接收介質(zhì)體積為8mL，擴散面積均為1.78cm2。接收室中設有磁力攪拌棒，保證受試物于接收液中能夠均勻擴散。4.2受試物配制稱取0.1000g咖啡因，置于10mL容量瓶中用生理鹽水定容，得到10000mg/L（1%）咖啡因溶液。（若要研究皮膚劑量-吸收曲線，則可增設濃度為0.3%和1%咖啡因溶液用于試驗）。取樣該溶液，經(jīng)前處理、稀釋等步驟，用液相檢測并計算溶液中咖啡因?qū)嶋H含量，用以計算實際加樣量。在正式試驗前，還應單獨測試咖啡因在接收液中的穩(wěn)定性。對剛配好的咖啡因溶液和試驗條件下放置24h取樣，檢測咖啡因含量有無變化。4.3接收液保證其滿足漏槽條件，即接收液的體積至少是咖啡因達到飽和溶解時所需介質(zhì)體積的3倍~10倍。成分組成：0.9%NaCl水溶液（生理鹽水）配制過程：根據(jù)以上成分組成，配制接收液。測定接收液pH，應保持在pH6.5~pH7.5范圍內(nèi)。測定咖啡因在接收液中的穩(wěn)定性：根據(jù)溶液中咖啡因濃度和加樣體積估算不同時間點的可能最高和最低濃度設計濃度曲線，于0.5、1、2、4、8、24h取樣檢測。4.4離體豬皮的制備離體豬皮采自豬背或腹側(cè)皮膚，符合相關(guān)動物倫理要求，保證豬皮角質(zhì)屏障的完整性（如不可采用熱水淋洗或刮毛，以確保皮膚角質(zhì)層完整性等）。用吸水紙吸干皮膚表面生理鹽水，肉眼觀察未受損傷的、面積大小合適的皮膚備用。本試驗中受試物均設置3個平行重復4次（皮膚來源為4個不同的個體）。4.6豬皮膚完整性檢查在受試物加樣前，通過測定經(jīng)皮水分流失（TEWL）值，以檢查皮膚的完整性：提前將水浴加熱調(diào)整到32±1℃并溫度穩(wěn)定，將皮膚安裝固定在擴散池的供給室和接收室之間，皮膚角質(zhì)層朝向供給室，真皮層一側(cè)朝向接收室,并通過補液管向接收室中加入接收液，去除接收液與皮膚間的氣泡，確保豬皮與接收液完全接觸，開啟磁力攪拌器轉(zhuǎn)速設為600rpm，擴散池體系在此狀態(tài)下平衡30min~45min。使用經(jīng)皮水分流失測定儀器于豬皮角質(zhì)層面測定TEWL值，TEWL值<15g/m2·h的皮膚才可用于試驗。5試驗步驟5.1加入接收液向接收室中加入接收液。通過加樣管加入接收液并記錄準確的接收液體積。接收液注入接收室后，去除皮膚與接收液接觸面滯留的氣泡，確保皮膚與接收液完全接觸。該擴散池體系在正常試驗條件下平衡30min~45min后，驗證皮膚完整性之后，方可加樣處理。向供給室中皮膚表面加入咖啡因測試溶液，并設置不含咖啡因的生理鹽水作為陰性對照。用移液器按照10μL/cm2的比例將17.8μL咖啡因溶液均勻涂布于供給室中1.78cm2皮膚表面，每個濃度樣品設3個平行重復4次。試驗期間保持實驗室環(huán)境濕度為30%~70%RH。設置磁力攪拌器以600rpm的速度攪拌，保持（32±1）℃恒溫水浴。5.2接收液取樣分別于0.5、1、2、4、8、24h時間點用注射器/自動取樣裝置取樣，具體取樣體積可根據(jù)化合物預實驗中表現(xiàn)出來的透過行為自行確定。0.22μm或0.45μm尼龍濾膜過濾后待測。暴露結(jié)束時取樣：供給室清洗：用15mL生理鹽水清洗（每次1mL，清洗15次），15次清洗液合并，再與皮膚表面殘留受試物沖洗液合并，一同檢測。皮膚表面殘留受試物：皮膚暴露于受試物樣品24h，用生理鹽水沖洗皮膚表面3次（每次用3mL生理鹽水，共9mL），所有沖洗液合并震蕩，0.22μm或0.45μm尼龍濾膜過濾后待測。角質(zhì)層：受試皮膚在干燥條件下，使用皮膚膠帶進行角質(zhì)層取樣，重復20次。取樣后將所有20張膠帶置于50mL離心管中，加入20mL甲醇震蕩過夜提取、離心，提取液過濾后待測。除去角質(zhì)層后的皮膚：去除角質(zhì)層后的皮膚剪碎，加入10mL甲醇過夜提取，離心取上清液過濾后待測。5.3檢測與分析儀器：高效液相色譜儀（HPLC）色譜柱:PhenomenexRPMAX-80A（4μm4.6mm×100mm）流動相:A（0.1%磷酸水溶液）和B（乙腈）洗脫程序:見表3流速：1.0mL/min進樣量：/柱溫：40℃ 檢測波長：273nm表1.梯度洗脫程序Time(min)A(v%)B(v%)09555.080206