鴨細(xì)小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范

鴨細(xì)小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范3超過(guò)24h;若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)在-70℃以下保存，避免反復(fù)凍融。用無(wú)菌剪刀和鑷子剪取待檢樣品，置組織勻漿器充分研磨，置于含2000IU/mL青霉素和2mg/mL鏈霉素的PBS(0.01moL/L,pH7.4)中，制成10%～20%懸浮液，凍融2次~3次，3000r/min,4℃離心10min,取上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌1.5mL離心管中。如果進(jìn)行病毒分離，則經(jīng)0.22pm7.1.89日齡～11日齡SPF鴨胚。7.2.1PBS(0.01moL/L.7.3.1將9日齡~11日齡SPF鴨胚用照蛋器照視檢查，并用鉛筆畫(huà)出氣室與胚胎位置，在氣室邊緣上2mm~8mm處避開(kāi)血管做一標(biāo)記，并在鴨胚絨毛尿囊膜血管相對(duì)較少一側(cè)氣7.3.2將鴨胚豎放在蛋座上，鈍端(氣室)向上。用5%碘前消毒蛋殼氣室后，用70%的酒精脫碘消7.3.3用1.0mL注射器吸取0.2mL處理好的樣品上清液，針頭刺入孔內(nèi)，經(jīng)絨毛尿囊膜注入尿囊腔，如圖1所示。每個(gè)樣品接種5個(gè)鴨胚。47.3.5對(duì)24h以后死亡鴨胚以及96h后仍存活的鴨胚，于4℃冷卻4h~12h后，無(wú)菌收取尿囊液，于-20℃冷凍保存。8.1.5Ⅱ級(jí)生物安全柜。8.1.6微量可調(diào)移液器(10p1,100μL、200pL、1mL.等不同規(guī)格),及其配套的無(wú)核酸酶處理的離心8.22PCR預(yù)混液(2×)。8.2.41.5%瓊脂糖凝膠(配制方法按照B.6)。8.2.5DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(分子大小范圍100bp~1000bp)。GCGACGCTGTCCGCCTTGTTGA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為659bp,擴(kuò)增片段位于鴨細(xì)小病毒Rep基因和5采用DNA提取試劑盒提取各類樣本中的病毒核酸，或用自動(dòng)化核酸提取儀提取各類樣本中的病毒核酸。如在2h內(nèi)檢測(cè)可將提取的核酸置于冰上保存，否則應(yīng)置于-20℃冷凍保存。8.4PCR檢測(cè)在體系配制區(qū)進(jìn)行PCR反應(yīng)體系配制。檢測(cè)DPV的PCR體系見(jiàn)表1。每次進(jìn)行PCR檢測(cè)應(yīng)設(shè)PCR孩混液(2×)112PCR反應(yīng)參數(shù)：951鎖變性5min;95℃30s、55℃30s,72℃40s,35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。制備含核酸染料質(zhì)量濃度為1.0ng/mL的1.5%瓊脂糖凝膠板，在電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠。取10pLPCR產(chǎn)物，與2.0mL6×加樣緩沖液混合，加入瓊劑遷移經(jīng)過(guò)凝膠約2/3長(zhǎng)度時(shí)結(jié)束電泳。將凝膠置于凝膠成像儀下觀察電符合8.5的條件，被檢樣品有大小為659bp的特異性擴(kuò)增條帶，則初步判定為鴨細(xì)小病毒核酸陽(yáng)進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參考序列(見(jiàn)附錄C)進(jìn)行比對(duì)，序列一致性達(dá)98%以上，則判為鴨組9實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(實(shí)時(shí)熒光PCR)9.1.2臺(tái)式低溫高速離心機(jī)。9.1.3Ⅱ級(jí)生物安全柜。9.1.5微量可調(diào)移液器(10mL、100pμL、200pL、1mL等不同規(guī)格),及其配套的無(wú)核酸酶處理的離心管和吸頭。9.2試劑和材料9.2.1病毒DNA提取試劑盒。9.2.2熒光PCR預(yù)混液(2×)。9.2.3空白對(duì)照(ddH?O)。9.2.4陰性對(duì)照(正常鴨胚尿囊液或正常鴨組織臟器)。9.2.5陽(yáng)性對(duì)照(含有DPV的鴨組織臟器、尿囊液或含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒)。9.2.6引物探針：上游引物DPV-qF:5'-CAAATTCCATCCTTCTCCAAATCT-3',下游引物DPV-qR;5'-TCTG-CAGGTACTGGTGTATTCTTGA-3),探針DPV-qP:s-FAM-CTGCACAATCCACCAGTCTTC-BHQ1-3',擴(kuò)增片段位于鴨細(xì)小病毒VP3基因的保守區(qū)域。方法同8.3.9.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)9.4.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系在體系配制區(qū)進(jìn)行實(shí)時(shí)靈光PCR體系配制，檢測(cè)DPV的實(shí)時(shí)熒光PCR體系見(jiàn)表2.陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照的設(shè)置同8.4.1。加人模板后充分混勻，瞬時(shí)離心，使液體沉降到PCR管底。表2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系熒光PCR預(yù)混液(2×)27熒光PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30s;95℃5s、60℃35s.35個(gè)循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)的60℃收檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Cr值讀取檢測(cè)結(jié)果。閥陽(yáng)性對(duì)照Ct值<30.0,并出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線：陰性對(duì)照無(wú)Ct值或Ct值235,并且無(wú)擴(kuò)增曲符合9.5.2的條件，被檢樣品Ct值≤32,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則判定為鴨細(xì)小病毒核酸陽(yáng)性：被檢樣品無(wú)Ct值，或Ct值≥35,并且無(wú)擴(kuò)增曲線，則判定為鴨組小病毒核酸陰性；被檢樣品Ct值在32~35之間，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，則需要重新檢測(cè)。若重新檢測(cè)Ct<35,則判為陽(yáng)性，無(wú)Cr值或Ct10.1經(jīng)5.4判定為疑似鴨細(xì)小病毒病·按第7章分離出鴨細(xì)小病毒，或經(jīng)第8章PCR方法、第9章實(shí)時(shí)熒光PCR方法任一項(xiàng)檢測(cè)出鴨組小10.2無(wú)明顯臨床癥狀的易感動(dòng)物，按第7章分離出鴨細(xì)小病毒，或經(jīng)第8章PCR方法、第9章實(shí)時(shí)熒9(規(guī)范性)試劑配制B.1磷酸鹽緩沖液(PBS.0.01mol/L.pH7.4)磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O磷酸二氫鉀(KH?PO)0.20g氯化鈉(NaCD)8.0g加雙燕水至100mL,調(diào)pH為7.4,121℃高壓滅菌20min,4℃保存。B.2青霉素溶液用無(wú)菌雙燕水配制，使青霉素濃度為10000IU/mL。經(jīng)0.22pm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存，有效期3個(gè)月。B.3鏈霉素溶液用無(wú)菌雙蒸水配制，使鏈霉素質(zhì)量濃度為10mg/mL。經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存，有效期3個(gè)月。B.450×TAE電泳緩沖液B.4.10.5mol/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA)溶液(pH8.0)稱取二水乙二胺四乙酸鈉1.44g.使用80mL雙蒸水充分溶解，使用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0,加雙蒸水至100mL,室溫保存。B.4.2TAE電泳緩沖液(50×1羥基甲基氨基甲烷(Trs242g冰乙酸57.1mL加雙燕水至1000mL,室溫保存。B.51×TAE電泳