KTB1344-CN-尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）原理尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphosphprylase，UGP，EC）在自然界廣泛分布。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，將1-磷酸葡萄糖與UTP分子合成為UDP-葡萄糖（UDPG），UDPG是高等植物和動(dòng)物中主要活化酶的形式，作為葡萄糖基供體參與糖原、蔗糖、纖維素等的合成代謝。CheKine?尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）可檢測(cè)動(dòng)植物組織、細(xì)胞、血清（漿）或其他液體樣本。在該試劑盒中，UGP可逆的催化生成1-磷酸葡萄糖，其在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉(zhuǎn)化為NADPH，UGP活性可以用340nm的吸光值的變化來(lái)反應(yīng)。包裝清單試劑盒組分規(guī)格儲(chǔ)存條件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠA6mL12mL4℃，避光保存ReagentⅠBPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentV1mL2mL4℃，避光保存注意：正式檢測(cè)前，建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計(jì)（能測(cè)340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：ExtractionBuffer有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。WorkingReagentⅠ：臨用前配制；將ReagentⅠB全部轉(zhuǎn)移至ReagentⅠA中，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。ReagentII：臨用前配制；48T加入1.2mL去離子水，96T加入2.4mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。ReagentIII：臨用前配制；48T加入1.2mL去離子水，96T加入2.4mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。ReagentIV：臨用前配制；48T加入1.2mL去離子水，96T加入2.4mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。ReagentV：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。測(cè)定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。細(xì)胞：收集500萬(wàn)細(xì)胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)胞30次（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。血清（漿）等液體樣本：直接檢測(cè)。注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3002的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm，紫外光分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中依次操作）：試劑空白孔（μL）測(cè)定孔（μL）WorkingReagentⅠ100100ReagentII2020ReagentIII2020ReagentIV2020ReagentV2020去離子水200樣本020充分混勻，記錄340nm處10s時(shí)吸光值A(chǔ)1，37℃反應(yīng)5min記錄310s時(shí)的吸光值A(chǔ)2。測(cè)定孔記為A測(cè)定，空白孔記為A空白。計(jì)算ΔA=(A2測(cè)定-A1測(cè)定)-(A2空白-A1空白)。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.05可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于0.6，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋?zhuān)?jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。若ΔA出現(xiàn)負(fù)值，則說(shuō)明樣本中不含UGP或已降解。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。UGP活性的計(jì)算使用96孔UV板測(cè)定的計(jì)算公式如下按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活單位定義：每毫克蛋白每分鐘消耗1nmolNADP定義為一個(gè)酶活力單位。UGP(U/mgprot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：酶活單位定義：每克樣本每分鐘消耗1nmolNADP定義為一個(gè)酶活力單位。UGP(U/g鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=321.54×ΔA÷W按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活單位定義：每104細(xì)胞每分鐘消耗1nmolNADP定義為一個(gè)酶活力單位。UGP(U/104cell)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(n×V樣÷V樣總)÷T=321.54×ΔA÷n按樣本體積計(jì)算酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmolNADP定義為一個(gè)酶活力單位。UGP(U/mL)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總)÷T=321.54×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；n：細(xì)胞數(shù)量，以萬(wàn)計(jì)。使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式將上述計(jì)算公式中光徑d：0.5cm調(diào)整為d：1cm進(jìn)行計(jì)算即可。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。Figure1.本試劑盒測(cè)定兔肝臟和玉米種子中UGP的活性。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB3030CheKine?乙醇