生物化學(xué) 藥本 第四章 蛋白質(zhì)的化學(xué)

第四章蛋白質(zhì)的化學(xué)目錄第一節(jié)蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理第七節(jié)蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)是一切生物細(xì)胞和組織的主要組成部分，是生命活動所依據(jù)的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.生物的各種生物功能也都靠蛋白質(zhì)體現(xiàn)。第一節(jié)蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)一、蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的基本成分分布廣:所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的高分子有機化合物，占人體干重的45%。某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)80%。

1.催化

蛋白質(zhì)的一個最重要的生物學(xué)功能是作為有機體新陳代謝的催化劑——酶。酶是蛋白質(zhì)中最大的一類。2、調(diào)節(jié)

許多蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)執(zhí)行其生理功能的能力，這些蛋白質(zhì)稱為調(diào)節(jié)蛋白3、免疫保護(hù)

抗體-識別進(jìn)入體內(nèi)的異體物質(zhì)，并與其結(jié)合而失活，使機體具有抵抗外界病原侵襲的能力。4、轉(zhuǎn)運和貯存

功能是從一地到另一地轉(zhuǎn)運特定的物質(zhì)；這類蛋白質(zhì)是氨基酸的聚合物，生物體必要時可利用蛋白質(zhì)作為提供充足氮素的一種方式。二、蛋白質(zhì)具有多樣性的生物學(xué)功能

5、運動與支持作為運動基礎(chǔ)的收縮和游動蛋白具有共同的性質(zhì)：它們都是絲狀分子或絲狀聚合體。

6、控制生長和分化

7、接受和傳遞信息

8、生物膜一、蛋白質(zhì)的元素組成

CHONS（50%）（7%）（23%）（16%）

（0～3%）Others:P、Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Se、I磷銅鐵鋅錳鈷硒碘

蛋白質(zhì)氮元素的含量都相當(dāng)接近，一般在15%—17％，平均為16％。這是凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的計算基礎(chǔ)。

第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成

6.25

—16％的倒數(shù)，每測定１g氮相當(dāng)于6.25g的蛋白質(zhì)。也就是1g氮所代表的蛋白質(zhì)量（克數(shù)）蛋白質(zhì)含量＝蛋白氮×6.25二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位

——

氨基酸（aminoacids)在自然界中存在的蛋白質(zhì)估計約有百億種，人體內(nèi)的蛋白質(zhì)也有10萬種以上。蛋白質(zhì)是高分子化合物，可以受酸、堿或蛋白酶作用水解為小分子物質(zhì)。蛋白質(zhì)徹底水解后，其基本組成單位為氨基酸。在自然界中存在的氨基酸有180種，但組成人體蛋白質(zhì)的基本氨基酸僅有20種。

（一）氨基酸結(jié)構(gòu)通式氨基酸的結(jié)構(gòu)特點1.氨基酸的氨基（－NH2）或亞氨基（==NH）都與鄰接羧基（－COOH）的a-碳原子相連接，故它們都屬于a-氨基酸（脯氨酸為a-亞氨基酸）。2.不同氨基酸在于R不同。3.除了R為H的甘氨酸外，其他氨基酸（包括脯氨酸）的a-碳原子都是手性碳原子（碳原子所連的4個原子或基團(tuán)互不相同）因而每種氨基酸都有兩種構(gòu)型：D型和L型均屬L-a-氨基酸（甘氨酸除外）H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R生物體內(nèi)的氨基酸類別

蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)中常見的20種氨基酸

稀有的蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)組成中，除上述20種常見氨基酸外，從少數(shù)蛋白質(zhì)中還分離出一些稀有氨基酸，它們都是相應(yīng)常見氨基酸的衍生物。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等。

非蛋白質(zhì)氨基酸：生物體內(nèi)呈游離或結(jié)合態(tài)的氨基酸。二十種常見蛋白質(zhì)氨基酸的分類、結(jié)構(gòu)及三字符號據(jù)營養(yǎng)學(xué)分類

必需ＡＡ非必需ＡＡ據(jù)R基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類

脂肪族ＡA（中性、含羥基或巰基、酸性、堿性）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)雜環(huán)ＡＡ(His、Pro)極性R基團(tuán)AA據(jù)R基團(tuán)極性分類非極性R基團(tuán)AA（８種）不帶電荷（７種）帶電荷：正電荷（３種）負(fù)電荷（２種）

人的必需氨基酸Lys

Trp

Phe

Val

Met

Leu

Ile

Thr

Arg、His按R基的極性性質(zhì)可以分成以下4組：非蛋白質(zhì)氨基酸蛋白質(zhì)氨基酸（20種）酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸堿性氨基酸賴氨酸組氨酸精氨酸中性氨基酸極性氨基酸非極性氨基酸絲氨酸蘇氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰胺谷氨酰胺甘氨酸丙氨酸亮氨酸異亮氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸色氨酸脯氨酸纈氨酸氨基酸（二）氨基酸的分類非極性R基團(tuán)氨基酸不帶電荷極性R基團(tuán)氨基酸帶電荷R基團(tuán)氨基酸1、常見的蛋白質(zhì)氨基酸1.非極性R基氨基酸

這一組中共有8種氨基酸a.4種帶有脂肪烴側(cè)鏈的氨基酸

丙氨酸（Ala）

纈氨酸（Val）

亮氨酸（Leu）

異亮氨酸（Ile）丙氨酸纈氨酸亮氨酸異亮氨酸b.2種含芳香環(huán)氨基酸

苯丙氨酸(Phe)

色氨酸(Trp)c.1種含硫氨基酸

甲硫氨酸（Met）d.1種亞氨基酸

脯氨酸(Pro)

苯丙氨酸色氨酸含芳香環(huán)氨基酸甲硫氨酸（蛋氨酸）脯氨酸2.極性但不帶電荷的R基氨基酸

這一組中有7種氨基酸a.側(cè)鏈的極性是由于它們的羥基造成的

蘇氨酸Thr

絲氨酸Ser

酪氨酸Tyrb.R基極性是它們的酰胺基引起的

天冬酰胺Asn

谷氨酰胺Gln

c.由于含有巰基的緣故

半胱氨酸Cys

d.側(cè)鏈介于極性與非極性之間

甘氨酸Gly絲氨酸酪氨酸蘇氨酸天門冬酰胺谷氨酰胺半胱氨酸甘氨酸3.帶負(fù)電荷的R基氨基酸

這一類的是兩種酸性氨基酸

天冬氨酸Asp

谷氨酸Glu

天門冬氨酸谷氨酸4.帶正電荷的R基氨基酸

這一類氨基酸在pH=7時攜帶凈正電荷，又叫堿性氨基酸

賴氨酸Lys：除

-氨基外，在脂肪鏈的

位置上還有一個氨基

精氨酸Arg:

含有一個帶正電荷的胍基

組氨酸His:有一個咪唑基精氨酸賴氨酸組氨酸2、不常見的蛋白質(zhì)氨基酸

3、非蛋白質(zhì)氨基酸

H2N-CH2-CH2-COOHH2N-CH2-CH2-CH2-COOH-丙氨酸-氨基丁酸

第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次一級結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要層次一級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)定義——1969年，國際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會（IUPAC）規(guī)定：

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。

一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

2.一級結(jié)構(gòu)的意義蛋白質(zhì)是由氨基酸聚合成的高分子化合物，在蛋白質(zhì)分子中，氨基酸之間通過肽鍵相連。氨基酸通過肽鍵連接起來形成的化合物稱為肽（peptide)（一）肽鍵和肽鏈?zhǔn)且环肿影被岬腶-羧基與另一分子氨基酸的a-氨基脫水縮和形成的酰胺鍵。+-HOHNH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-CHOOH甘氨酸

NH-CH-CHOOHH甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽鍵N-末端C-末端

—

側(cè)鏈—

R1OR2OR3OR4

H2N—CH—C—NH—CH—C—NH—CH—C—NH—CH—COOHH－－OH兩個氨基酸縮合————二肽三個氨基酸縮合————三肽多個氨基酸縮合————多肽。多肽呈鏈狀，因此稱多肽鏈氨基酸通過—肽鍵相連而形成的化合物稱為肽。多肽鏈中的氨基酸因脫水縮合而稍有殘缺——氨基酸殘基

多肽鏈中由肽鍵連接成的長鏈骨架——多肽主鏈

各氨基酸殘基的R基團(tuán)——多肽側(cè)鏈

自然界中有自由存在的活性肽，主要有：1.谷胱甘肽（GSH）：三肽（Glu—Cys—Gly），含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護(hù)某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。

分子中具有一個由谷氨酸的

-羧基和半胱氨酸的

-氨基脫水縮合的

-肽鍵2.腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用，它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中形成，是體內(nèi)自己產(chǎn)生的一類鴉片劑。3.牛催產(chǎn)素與加壓素：

均為九肽，分子中含有一對二硫鍵，兩者結(jié)構(gòu)類似。前者第八位為Leu，后者為Arg。前者可刺激子宮的收縮，促進(jìn)分娩。后者可促進(jìn)小動脈收縮，使血壓升高，也有抗利尿作用，參與水、鹽代謝的調(diào)節(jié)。

牛催產(chǎn)素

SS Cys·Tyr·Ile·Gln·Asn·Cys·Pro·Leu·Gly-NH2

牛加壓素

SS Cys·Tyr·Phe·Gln·Asn·Cys·Pro·Arg·Gly-NH2

（二）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的原理1.測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的要求：a、樣品必須是均一的，純度應(yīng)在97%以上；b、知道蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，其誤差允許在10%左右；

2.測定一級結(jié)構(gòu)的基本原理和方法基本策略：

氨基酸順序直測法＋片段重疊法基本步驟：(1)測定末端氨基酸數(shù)目，確定蛋白質(zhì)分子是由幾條肽鏈構(gòu)成的；(2)拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈，斷開多肽鏈內(nèi)二硫鍵并分離出每條肽鏈。(3)將肽鏈完全水解，測定每條多肽鏈的氨基酸組成(4)鑒定多肽鏈N－末端、C－末端氨基酸殘基(5)至少用兩種方法將多肽鏈水解成較小的片段；(6)分離并測定各肽段的氨基酸序列；(7)片段重疊法重建完整多肽鏈一級結(jié)構(gòu)；(8)確定半胱氨酸殘基間形成二硫鍵交聯(lián)橋的位置。將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序

將肽段分離并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)順序測定基本方法路線1、測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)相對分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。2、拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈，斷開多肽鏈內(nèi)二硫鍵胰島素

-巰基乙醇碘乙酸二硫鍵的斷裂

幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的

-巰基乙醇(還原法)處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑（ICH2COOH）保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。3、分析每一條多肽鏈的氨基酸組成

經(jīng)分離、純化的多肽鏈一部分樣品進(jìn)行完全水解，測定它的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。4、鑒定多肽鏈N－末端、C－末端氨基酸殘基

Sanger法（二硝基氟苯反應(yīng)）

DNS法（二甲氨基萘磺酰氯反應(yīng)）

Edman法（苯異硫氰酸反應(yīng)）氨肽酶法肼解法羧肽酶法

N端C端(1)Sanger法DNFB（二硝基氟苯）反應(yīng)黃色:根據(jù)它在薄層層析或紙電泳中的遷移特性進(jìn)行鑒定(2)（DNS法）二甲氨基萘磺酰氯反應(yīng)-HCl+氨基酸混合物水解多肽多肽DNS-氨基酸具有熒光(3)Edman法（苯異硫氰酸反應(yīng)）PITC無N-端氨基的剩余部分用層析法分離(4)氨肽酶法從多肽鏈的N未端依次切掉氨基酸

NH2

aaaaaaaa…….

據(jù)一定時間內(nèi)釋放出的AA的數(shù)量和種類來推測.

C-未端的測定方法1.肼解法

是目前最好的方法

用色譜法鑒定

多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。

注:末端若為半胱氨酸或胱氨酸就不能用此法，必須烷基化后再肼解。2.羧肽酶的方法

是目前最有效也是最常用的方法。

羧肽酶是一類肽鏈外切酶，它專一地從肽鏈的C－端依次切下一個氨基酸殘基，釋放出游離的氨基酸。據(jù)一定時間內(nèi)切下的數(shù)量來測氨基酸的數(shù)量。酶解法：如胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶化學(xué)法：如溴化氰法羥胺法5、裂解多肽鏈成較小的片段胰蛋白酶R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶：R1=Phe,Trp,Tyr時水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。胃蛋白酶R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro水解受抑嗜熱菌蛋白酶R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly

水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑?；瘜W(xué)法：可獲得較大的肽段溴化氰水解法：它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。羥胺（NH2OH）：專一性斷裂-Asn-Gly-之間的肽鍵。也能部分裂解-Asn-Leu-之間的肽鍵以及-Asn-Ala-之間的肽鍵。6、測定各肽段的氨基酸序列

基本方法：

Sanger法

Edman降解法

DNS-Edman測序法

蛋白質(zhì)順序儀測序7、片段重疊法重建完整多肽鏈一級結(jié)構(gòu)

所得資料：

氨基末端殘基H

羧基末端殘基S

第一套肽段第二套肽段

OUS

SEO

PS

WTOU

EOVE

VERL

RLA

APS

HOWT

HO末端殘基HS末端肽段HOWT

APS第一套肽段HOWT

OUS

EOVE

RLA

PS第二套肽段HO

WTOU

SEO

VERL

APS

推斷全順序HOWTOUSEOVERLAPS

借助重疊法確定肽段次序：8、確定半胱氨酸殘基間形成二硫鍵交聯(lián)橋的位置

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的順序測定完成后，將未拆開二硫鍵的同一種蛋白質(zhì)再一次進(jìn)行專一性的酶解，由此就可以確定完整的蛋白質(zhì)中二硫鍵的位置。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。1、采用胃蛋白酶水解：切點多，生成的肽段包括含二硫鍵的肽段都比較?。凰嵝原h(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換，二硫鍵穩(wěn)定。2、將所得的肽段利用對角線電泳技術(shù)進(jìn)行分離。3、然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。二硫鍵位置的確定對角線電泳：把水解的混合肽段點到濾紙中央，在pH6.5的條件下，進(jìn)行第一向電泳，肽段將按其大小及電荷的不同分離開來。然后把濾紙暴露在過甲酸蒸氣中，使-S-S-斷裂。這時每個含二硫鍵的肽段被氧化成一對含半胱氨磺酸的肽。濾紙旋轉(zhuǎn)90度角在與第一向完全相同的條件下進(jìn)行第二向電泳。在這里，大多數(shù)肽段的遷移率未變，并將位于濾紙的一條對角線上，而含半胱氨磺酸的肽段比原來含二硫鍵的肽小而負(fù)電荷增加，結(jié)果它們都偏離了對角線。肽斑可用茚三酮顯色確定。+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段二硫鍵位置的確定核酸推導(dǎo)法測出核酸的核苷酸順序，即可根據(jù)三個核苷酸確定一個氨基酸是密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)的氨基酸順序的原理。對經(jīng)典化學(xué)法難以分析的大分子蛋白質(zhì)或生物體含量很低的蛋白質(zhì)，應(yīng)用此法十分有效。

二、蛋白質(zhì)的構(gòu)象定義：指蛋白質(zhì)分子內(nèi)各原子圍繞某些共價鍵的旋轉(zhuǎn)而形成的各種空間排布及相互關(guān)系，這種空間結(jié)構(gòu)稱為蛋白質(zhì)的構(gòu)象。蛋白質(zhì)的構(gòu)象是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，是表現(xiàn)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能或活性所必需。

是指具有相同結(jié)構(gòu)式和相同構(gòu)型的分子在空間里可能的多種形態(tài)，構(gòu)象形態(tài)間的改變不涉及共價鍵的破裂。指在具有相同結(jié)構(gòu)式的立體異構(gòu)體中取代基團(tuán)在空間的相對取向，不同的構(gòu)型如果沒有共價鍵的破裂是不能互變的。構(gòu)象構(gòu)型蛋白質(zhì)構(gòu)象分為主鏈構(gòu)象側(cè)鏈構(gòu)象是指多肽主鏈骨架上各原子（包括各氨基酸殘基的α－碳原子及肽鍵有關(guān)原子）的排布及相互關(guān)系指各氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)（R）中原子的排布及彼此關(guān)系a.鹽鍵b.氫鍵c.疏水鍵d.范得華力e.二硫鍵多肽鏈（一）維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵

維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力

氫鍵：

x—H…y（N-H…O,O-H…0)

疏水作用力：是指非極性基團(tuán)即疏水基團(tuán)為了避開水相而群集在一起的集合力

范德華力：在物質(zhì)的聚集狀態(tài)中，分子與分子之間存在著一種較弱的作用力

離子鍵：它是由帶相反電荷的兩個基團(tuán)間的靜電吸引所形成的二硫鍵：是兩個硫原子之間所形成的共價鍵化學(xué)鍵共價鍵次級鍵肽鍵二硫鍵氫鍵疏水鍵鹽鍵范德華力一級結(jié)構(gòu)二、三、四級結(jié)構(gòu)三、四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中的共價鍵與次級鍵（二）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

定義：是指多肽鏈主鏈原子的局部空間結(jié)構(gòu)，不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。主要的化學(xué)鍵：氫鍵肽平面或酰胺平面：

組成肽單位的4個原子和2個相鄰的α碳原子都處于同一個平面內(nèi)，此剛性結(jié)構(gòu)的平面稱為肽平面或酰胺平面。肽單位：實際就是一個肽平面l.形成二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)肽單位

肽鍵的四個原子和與之相連的兩個α-碳原子所組成的基團(tuán)。肽鍵N=C0.127nm鍵長=0.132nmN-C0.148nm肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。

肽單元(peptideunit)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的基本形式1.a-螺旋：2.β-折疊3.β-轉(zhuǎn)角4.無規(guī)則卷曲β-折疊β-轉(zhuǎn)角無規(guī)則卷曲

空穴α-螺旋多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離為0.15nm;

每個aa殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100度.肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，每個氨基酸殘基的C=O氧與其后第四個氨基酸殘基的N-H氫形成氫鍵。（1）1.-螺旋及結(jié)構(gòu)特點2.

-螺旋（1）

-螺旋螺距0.54nm每殘基的軸向高度0.15nm每殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100o絕大多數(shù)天然蛋白質(zhì)中的

-螺旋幾乎都是右手螺旋。

-螺旋都是由L-型氨基酸構(gòu)成的（Gly除外）。（2）α-螺旋結(jié)構(gòu)形成的限制因素:與ＡＡ組成和排列順序直接相關(guān)。凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽鍵N原子上沒有H,不可能形成氫鍵。靜電斥力。若一段肽鏈有多個Glu或Asp相鄰,則因pH=7.0時都帶負(fù)電荷,防礙α螺旋的形成;同樣多個堿性氨基酸殘基在一段肽段內(nèi),正電荷相斥,也防礙α螺旋的形成。位阻。如Asn、Leu側(cè)鏈很大，防礙α螺旋的形成。3.

-折疊（

-pleatedsheet）

-折疊或

-折疊片也稱

-結(jié)構(gòu)或

-構(gòu)象，它是蛋白質(zhì)中第二種最常見的二級結(jié)構(gòu)。

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵進(jìn)行交聯(lián)而形成的，或一條肽鏈內(nèi)的不同肽段間靠氫鍵而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象

-折疊結(jié)構(gòu)幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。

-折疊有兩種類型：一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反

-折疊的特點NNN平行式NCN反平行式（3）β-轉(zhuǎn)角（β-turn）為了緊緊折疊成緊密的球蛋白，多肽鏈常常反轉(zhuǎn)方向，成發(fā)夾形狀。一個氨基酸的羰基氧以氫鍵結(jié)合到相距的第四個氨基酸的氨基氫上。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-轉(zhuǎn)角經(jīng)常出現(xiàn)在連接反平行β-折疊片的端頭。

-回折（或發(fā)夾結(jié)構(gòu)）在

-轉(zhuǎn)角部分，由四個氨基酸殘基組成;彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O和第四個殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。其特點是肽鏈回折180度★目前發(fā)現(xiàn)的

-轉(zhuǎn)角多數(shù)都存在蛋白質(zhì)分子表面，它們的含量相當(dāng)豐富，約占全部AA殘基的1/4。4.無規(guī)卷曲或自由回轉(zhuǎn)

肽段在空間的不規(guī)則排布稱為無規(guī)則卷曲。在一般球蛋白分子中，往往含有大量的無規(guī)則卷曲，它使蛋白質(zhì)肽鏈從整體上形成球狀構(gòu)象。無規(guī)則卷曲示意圖無規(guī)則卷曲細(xì)胞色素C的三級結(jié)構(gòu)（三）超二級結(jié)構(gòu)1.超二級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)中相鄰的二級結(jié)構(gòu)單位（

-螺旋或

-折疊或

-轉(zhuǎn)角）組合在一起，形成有規(guī)則的、在空間上能夠辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體。2.超二級結(jié)構(gòu)的基本類型：

、

X、

定義：對于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨立的三維實體締合而成三級結(jié)構(gòu)，這種相對獨立的三維實體稱結(jié)構(gòu)域?，F(xiàn)在,結(jié)構(gòu)域的概念有三種不同而又相互聯(lián)系的涵義:即獨立的結(jié)構(gòu)單位、獨立的功能單位和獨立的折疊單位。(四）結(jié)構(gòu)域類型：

α-螺旋域；β-折疊域；α+β域；

α/β域；無規(guī)則卷曲+β-回折域；無規(guī)則卷曲+α-螺旋結(jié)構(gòu)域兩個鐵原子蚯蚓血紅蛋白中四個

-螺旋組成的結(jié)構(gòu)域

α-螺旋域；免疫球蛋白VLβ-折疊結(jié)構(gòu)域β-折疊域；丙酮酸激酶結(jié)構(gòu)域4α/β結(jié)構(gòu)域

3-P-甘油醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域2α+β結(jié)構(gòu)域木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)域1無規(guī)則卷曲+α-螺旋結(jié)構(gòu)域木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)域2無規(guī)則卷曲+β-回折結(jié)構(gòu)域1、

定義指一條多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象相互作用，沿三維空間多方向卷曲，進(jìn)一步盤曲折疊形成特定的球狀分子結(jié)構(gòu)。

在三級結(jié)構(gòu)中，具有極性側(cè)鏈基團(tuán)的AA殘基幾乎全部在分子的表面,而非極性殘基則被埋于分子內(nèi)部,不與水接確.而形成疏水的核心。（五）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域1結(jié)構(gòu)域2-折疊-轉(zhuǎn)角二硫鍵-螺旋溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)中的兩個結(jié)構(gòu)域3、三級結(jié)構(gòu)的特征：

含多種二級結(jié)構(gòu)單元；

有明顯的折疊層次；

是緊密的球狀或橢球狀實體；

分子表面有一空穴(活性部位)；

疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，

親水側(cè)鏈暴露在分子表面。實例：肌紅蛋白4、肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能（1）肌紅蛋白的功能：哺乳動物肌肉中儲存氧并運輸氧的蛋白。（2）肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)特點：

1963年，Kendrew

a.一條多肽鏈，153個氨基酸殘基，一個血紅素輔基，分子量17600道爾頓。

b.肌紅蛋白的整個分子具有外圓中空的不對稱結(jié)構(gòu)，肽鏈共折疊成8段長度不等的

-螺旋體（A-H），最長的有23個氨基酸殘基，最短的有7個氨基酸殘基。拐彎處多由Pro、Ser、Ile、Thr等組成。

c.具有極性側(cè)鏈的氨基酸殘基分布于分子表面，而帶非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基多分布于分子內(nèi)部，使肌紅蛋白成為可溶性蛋白。肌紅蛋白血紅素輔基抹香鯨肌紅蛋白（Myoglobin）的三級結(jié)構(gòu)5、煤氣中毒的機制

一氧化碳（CO）也能與血紅素Fe原子結(jié)合。由于CO與血紅素的結(jié)合能力是O2的200倍，因此，人體吸入少量的CO即可完全抑制肌紅蛋白或血紅蛋白與O2的結(jié)合，從而造成缺氧死亡。急救方法是盡快將病人轉(zhuǎn)移到富含O2的環(huán)境中（如新鮮空氣、純氧氣或高壓氧氣），使與血紅素結(jié)合的CO被O2置換出來。四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)

四級結(jié)構(gòu)是指由兩個或兩個以上具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈按一定方式聚合而成的特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。其中每條多肽鏈稱為亞基。通常亞基只有一條多肽鏈，但有的亞基由兩條或多條多肽鏈組成，這些多肽鏈間多以二硫鍵相連亞基單獨存在時無生物學(xué)活性。一般來說具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白屬于寡聚蛋白。1.定義一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)2.維持蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的主要作用力在蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中，亞基之間的作用力主要包括：氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水鍵。即亞基之間主要是通過次級鍵彼此締合在一起。疏水鍵是最主要的作用力。3.血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能（1）血紅蛋白的結(jié)構(gòu)特點：a.是四個亞基的寡聚蛋白，574個AA殘基，分子量65000b.是由相同的兩條

鏈和兩條

鏈組成四聚體

2

2，成人的血紅蛋白為

2

2、胎兒的血紅蛋白為

2

2c.鏈由141AA殘基組成，

鏈由146AA殘基組成。四條肽鏈的三級結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白相似，各自內(nèi)部有一個血紅素輔基。（2）血紅蛋白的功能：存在于動物血液的紅細(xì)胞中，具有運輸O2和CO2的功能；血紅蛋白還能和H+結(jié)合，從而可以維持體內(nèi)pH.血紅蛋白四級結(jié)構(gòu)血紅素輔基化學(xué)鍵共價鍵次級鍵肽鍵二硫鍵氫鍵疏水鍵鹽鍵范德華力一級結(jié)構(gòu)二、三、四級結(jié)構(gòu)三、四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中的共價鍵與次級鍵三、蛋白質(zhì)和多肽合成的基本原理（一）化學(xué)合成法的基本原理（二）采用生物技術(shù)合成蛋白質(zhì)1.基因工程2.細(xì)胞工程3.酶工程一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

1.同功蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異性

細(xì)胞色素C是真核細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上一種含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)，在生物氧化中起傳遞電子的作用。通過植物、動物和微生物等數(shù)百種生物的細(xì)胞色素C一級結(jié)構(gòu)的研究表明：

（1）親緣關(guān)系越近，AA順序的同源性越大。（2）盡管不同生物間親緣關(guān)系差別很大，但與細(xì)胞色素C功能密切相關(guān)的AA順序卻有共同之處，即保守順序不變第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能不同生物與人的細(xì)胞色素C相比較AA差異數(shù)目黑猩猩0雞、火雞13

牛豬羊10海龜15

狗驢11小麥35

粗糙鏈孢霉43酵母菌44生物與人不同的AA數(shù)目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、豬、羊、狗11馬12雞、火雞13響尾蛇14海龜15金槍魚21角餃23小蠅25蛾31小麥35粗早鏈孢霉43酵母44不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目根據(jù)細(xì)胞色素C的順序種屬差異建立起來的進(jìn)化樹圓圈代表分歧點2.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的變異與分子病

分子病—指蛋白質(zhì)分子中由于AA排列順序與正常蛋白質(zhì)不同而發(fā)生的一種遺傳病(基因突變造成的)。鐮刀形貧血?。翰∫颍貉t蛋白AA順序的細(xì)微變化

-鏈N端氨基酸排列順序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…

Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…鐮刀形貧血?。翰∪梭w內(nèi)血紅蛋白的含量乃至紅細(xì)胞的量都較正常人少，且紅細(xì)胞的形狀為新月形，即鐮刀狀。此種細(xì)胞壁薄，而且脆性大，極易漲破而發(fā)生溶血；再者，發(fā)生鐮變的細(xì)胞粘滯加大，易栓塞血管；由于流速較慢，輸氧機能降低，使臟器官供血出現(xiàn)障礙，從而引起頭昏、胸悶而導(dǎo)致死亡。正常紅細(xì)胞鐮刀形紅細(xì)胞正常紅細(xì)胞與鐮刀形紅細(xì)胞的掃描電鏡圖

谷氨酸在生理pH值下為帶負(fù)電荷R基氨基酸，而纈氨酸卻是一種非極性R基氨基酸，就使得HbS分子表面的荷電性發(fā)生改變，引起等電點改變，溶解度降低，使之不正常地聚集成纖維狀血紅蛋白，致使紅細(xì)胞變形成鐮刀狀,輸氧功能下降,細(xì)胞脆弱易溶血.鐮刀型貧血病1.蛋白質(zhì)前體的活化胰島素原與胰島素（豬胰島素原的激活）

ArgLysArg（C肽）二、蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象與功能的關(guān)系未結(jié)合O2時，Hb的α1/β1和α2/β2呈對角排列，結(jié)構(gòu)較為緊密，稱為緊張態(tài)(tensestate,T態(tài))，T態(tài)Hb與O2

的親和力小。隨著O2

的結(jié)合，4個亞基羧基末端之間的鹽鍵斷裂，其二級、三級和四級結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，使α1/β1和α2/β2的長軸形成15°的夾角，結(jié)構(gòu)顯得相對松弛，稱為松弛態(tài)(relaxedstate,R態(tài))。

血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病阮病毒蛋白空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵2.蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性一、蛋白質(zhì)的大小與分子量二、兩性解離性質(zhì)及等電點三、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性五、蛋白質(zhì)的沉淀六、蛋白質(zhì)的紫外吸收與顏色反應(yīng)七、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的大小與分子量生物大分子：是由某些基本單位按一定順序和方式連接所形成的多聚體（polymer），M一般大于10000。包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類及糖等?！锏鞍踪|(zhì)分子量的變化范圍很大，從大約

6000—1000000道爾頓（Da）或更大?！?/p>

某些蛋白質(zhì)是由兩個或更多個蛋白質(zhì)亞基(多肽鏈)通過非共價結(jié)合而成，稱寡聚蛋白質(zhì)。有些寡聚蛋白質(zhì)的分子量可高達(dá)數(shù)百萬甚至數(shù)千萬道爾頓?！?/p>

測定蛋白質(zhì)分子量的方法有：超速離心法、分子篩層析法、SDS、生物質(zhì)譜法等等。二、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性蛋白質(zhì)的變性定義天然蛋白質(zhì)因受物理、化學(xué)因素的影響，使蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生了異常變化，從而導(dǎo)致生物活性的喪失以及物理、化學(xué)性質(zhì)的異常變化。但一級結(jié)構(gòu)未遭破壞，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。1、蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)：

分子中各種次級鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級結(jié)構(gòu)不破壞。

變性后的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上雖有改變，但組成成分和相對分子質(zhì)量不變。2、蛋白質(zhì)的變性作用的特征（1）生物活性喪失；（2）某些良好性質(zhì)的改變：溶解度降低，對于球狀蛋白粘度增加；光吸收系數(shù)增大；生物化學(xué)性質(zhì)改變。3、引起蛋白質(zhì)變性的主要因素：1.物理因素：加熱、高壓、紫外線照射、X-射線、超聲波、劇烈振蕩和攪拌等2.化學(xué)因素：強酸、強堿、脲、去污劑（十二烷基硫酸鈉（SDS））、重金屬鹽、三氯醋酸、濃乙醇等。蛋白質(zhì)變性在臨床上應(yīng)用消毒滅菌：高溫、高壓、酒精、紫外線搶救誤服重金屬鹽患者：可口服牛奶或生蛋清以減緩重金屬離子的吸收保存生物制品：活性蛋白質(zhì)制劑如酶、疫苗等放在適宜的低溫下（4℃）保存，以防止其變性失活。蛋白質(zhì)的復(fù)性

定義：如果引起變性的因素比較溫和，蛋白質(zhì)構(gòu)象僅僅是有些松散時，當(dāng)除去變性因素后，可根據(jù)熱力學(xué)原理緩慢地重新自發(fā)折疊恢復(fù)原來的構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱作復(fù)性。核糖核酸酶變性與復(fù)性作用天然狀態(tài)，有催化活性

非折疊狀態(tài)，無活性8M尿素

-巰基乙醇變性天然狀態(tài)–S-S-鍵恢復(fù)而且是正確配對復(fù)性去除尿素及

-巰基乙醇NH3+PPPCOO-

NH3+NH2COOHCOO-OH-H+OH-H+蛋白質(zhì)正離子蛋白質(zhì)兩性離子蛋白質(zhì)負(fù)離子(pH＜pI)(pH=pI)(pH＞pI)PNH2COOH三、蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點三、蛋白質(zhì)的兩性離解和等電點

蛋白質(zhì)的等電點：當(dāng)溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中即不向陽極移動也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點（pI）。在等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。

在外液pH低于等電點的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動；在外液pH高于等電點的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳。各種蛋白質(zhì)具有特定的pI，這與其分子中所含酸性和堿性基團(tuán)的數(shù)目及解離程度有關(guān)。含酸性氨基酸殘基多的蛋白質(zhì)其PI偏酸，含堿性氨基酸殘基多的蛋白質(zhì)其pI偏堿。人體大多數(shù)蛋白質(zhì)pI在5.0左右，所以在生理條件下（pH7.4）它們以負(fù)離子形式存在。電泳:帶電粒子在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱電泳。電泳的方向取決于帶電粒子帶電荷的性質(zhì)，電泳的速度取決于帶電粒子電荷的多少，分子質(zhì)量的大小等。帶電荷量大，分子質(zhì)量小者，泳動快，反之泳動慢。用醋酸纖維薄膜電泳可將血清蛋白質(zhì)分為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等5種成分臨床用以幫助疾病的診斷和觀察病程。蛋白質(zhì)多肽鏈上含有許多極性基團(tuán)。如：－NH3＋、－COO－、－OH、-SH、-CONH-等，它們都具有高度的親水性，當(dāng)與水接觸時，極易吸附水分子，使蛋白質(zhì)顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。四、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)

由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成直徑1-100nm之間的顆粒，已達(dá)到膠體顆粒范圍的大小，因而具有膠體溶液的通性。蛋白質(zhì)的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因：

1.蛋白質(zhì)表面具有水化層2、蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在非等電狀態(tài)時，相同蛋白質(zhì)顆粒帶有同性電荷，與周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層與同性電荷兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對穩(wěn)定的。蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用

由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。透析法：以半透膜提純蛋白質(zhì)的方法叫透析法半透膜：只允許溶劑小分子通過，而溶質(zhì)大分子不能通過，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等五、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)

蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對的。如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。定義：蛋白質(zhì)在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀下來，此現(xiàn)象即為蛋白質(zhì)的沉淀作用。（一）可逆沉淀定義：在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。1.

鹽析

在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強電解質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。

而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機理：

破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。

各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分散沉淀析出，這種方法稱為分段鹽析。2.弱酸或弱堿沉淀法(等電點沉淀）

用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處于等電點處，使蛋白質(zhì)沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機理：

破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。酸酸堿堿堿酸溶液中蛋白質(zhì)的聚沉3.

有機溶劑沉淀法：在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。有機溶劑沉淀法的機理：

破壞蛋白質(zhì)的水化膜。注意：有機溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進(jìn)行，否則有機溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。（二）不可逆沉淀定義：在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀（次級鍵）、強酸堿沉淀（影響電荷）、重金屬鹽沉淀（Hg2+、Pb2+

、Cu2+、Ag2+）和生物堿試劑或某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀。4.重金屬鹽沉淀(條件：pH稍大于pI為宜)

當(dāng)pH稍大于pI時，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷這樣就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。

重金屬沉淀法的機理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。5.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）

生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。

生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。

6.加熱變性沉淀法

幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速.

如：煮雞蛋酶的制備：超氧化物歧化酶的提取六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)酚試劑反應(yīng)蛋白質(zhì)定量、定性

茚三酮反應(yīng)

測定常用方法

另外還有：蛋白黃色反應(yīng)、米倫氏反應(yīng)、乙醛酸反應(yīng)等。

1、與茚三酮反應(yīng)茚三酮在弱酸性溶液中與α-氨基酸共熱，氨基酸被氧化成醛、CO2和NH3，最后茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物──氨和還原茚三酮發(fā)生作用，生成藍(lán)紫色化合物。

兩個亞氨基酸──脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)形成黃色化合物。OH羥NH3CO2RCHO+還原性茚三酮+(弱酸)加熱3H20氨基酸與茚三酮反應(yīng)水合性茚三酮+2NH3+水合性茚三酮還原性茚三酮藍(lán)紫色化合物

雙縮尿在堿性溶液中能與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。(堿性溶液)Cu2+紅紫色絡(luò)合物180°C2.雙縮脲反應(yīng)-蛋白質(zhì)的定性和定量

蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280

260測定范圍：0.1～0.5mg/ml

六、蛋白質(zhì)的紫外吸收

七、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)（略）1.抗原（Ag）2.抗體（Ab）3.蛋白質(zhì)免疫性質(zhì)的應(yīng)用一.

分離純化蛋白質(zhì)的意義

1.研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：

要求純度高，不變性；2.提取活性的酶或蛋白質(zhì)：

必須保持天然活性狀態(tài)；3.作為藥物或食品添加劑：

純度要求一般。二、蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)：

增加制品純度或比活力，設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其他雜蛋白，且希望所得的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理

三.蛋白質(zhì)分離純化的一般程序1.前處理

生物組織破碎、溶解、離心分離蛋白質(zhì)提取液2.粗分級鹽析、等電點沉淀、超濾、有機溶劑分級分離3.細(xì)分級層析、電泳精制品4.結(jié)晶結(jié)晶或凍干粉

適宜介質(zhì)2、根據(jù)溶解度分等電點沉淀鹽析（常用硫酸銨）有機溶劑沉淀3、根據(jù)電離性質(zhì)分電泳離子交換層析1、根據(jù)分子大小分透析或超濾離心沉淀凝膠過濾層析四、分離純化的方法4、特異親和力：親和層析沉降平衡離心法沉降速度離心法凝膠電泳法凝膠過濾層析原理五、蛋白質(zhì)的利用

1.在食品方面的利用牲畜、家禽、魚的肌肉以及蛋、奶等歷來作為美味食物的人類提供大量營養(yǎng)所必需的蛋白質(zhì)?！疤鹞兜鞍住?.在醫(yī)藥方面和利用

如“胰島素”、“干擾素”3.在飼料方面的利用如“葉蛋白”第七節(jié)、蛋白質(zhì)的分類

1、按化學(xué)組成分類單純蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)部分+非蛋白部分

2、按分子形狀分類球狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)

3、按功能分類活性蛋白質(zhì)非活性蛋白質(zhì)1.分子組成

簡單蛋白（按溶解度）

結(jié)合蛋白（按輔基）清蛋白球蛋白谷蛋白醇溶蛋白精蛋白組蛋白硬蛋白核蛋白糖蛋白與蛋白聚糖脂蛋白色蛋白磷蛋白2.按分子的形狀或空間構(gòu)