（高清版）DB37∕T 2038-2012 牛尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程　

DB37DB37/T2038—2012牛尿苷酸合酶缺乏癥（DUMPS）分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程Technicalspecificationofdetectionfordeficiencyofuridinemonophophatesynthaseinbovine2012-02-09發(fā)布2012-03-01實(shí)施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用NY/T1672-2008綿羊多胎主效基因FecB分子尿苷酸合酶缺乏癥deficiencyofuridinemonoph尿甘酸合酶缺乏癥是由于牛體內(nèi)尿苷酸合酶（UridineMonophophateSynthase，UMPS）基因的C-DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribo2尿甘酸合酶缺乏癥是由于奶牛體內(nèi)尿苷酸合酶（UMPS）基因的C-末端405處的密碼子存在一個(gè)點(diǎn)突胚胎早期死亡。基于這個(gè)點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)引物對(duì)該區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及RFLP分析，由于野生型與突變型個(gè)除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-2008的雙蒸水下游引物：5'-GCTTCTAACTGAACTCCT3DB37/T2038—200.5μL,10pmol/μL的上、下游引物各0.5μL,TaqDNA聚合酶1U,DNA模板100ng,加雙蒸水至208.5.2PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)8.5.3PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)再用1×TAE沖洗一次，水平放置。稱(chēng)取溶液澄清透明，室溫下冷卻至60℃左右時(shí)，加入溴化乙錠并混勻，使其終濃度為0.5μg/mL,即得1%8.6RFLP分析8.6.1RFLP酶切體系10μL酶切體系：PCR產(chǎn)物1.0μL,限制性?xún)?nèi)切酶AVaI(10U/μL)0.3μL,10×Buffer1μL,超純水8.7μL,37℃水浴消化過(guò)夜。9.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為95bp,條帶清晰(見(jiàn)圖1),可進(jìn)行下一步檢測(cè)。圖1UMPS基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(DL2000DNAMaker)4子(-/+),如圖2(另有21bp酶切片段由于片段較小，電泳中沒(méi)有顯示)。M-1--1--/+-1--1--/+-1-M-1--1--/+-1--1--/+-1-圖2酶切產(chǎn)物SDS電泳結(jié)果(50bpDNALander)5主要儀器設(shè)備A.2單道可調(diào)移液器：2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000A.5恒溫振蕩器：0r/min～200r/min，0℃~60℃6稱(chēng)取SDS2g，加超純水18mL，加熱至68℃助溶，B.60.5mol/LEDTA(10mmol/LTris?Cl（pH8.0）、07﹪（B.1730﹪丙烯酰胺（49：1）丙烯酰胺147g和N，N′-亞甲雙丙烯酰胺3g溶解于400mL水中，將溶液加熱至37℃溶解，完全溶解后89C.7加入1mL75﹪的冰乙醇（-20℃)洗滌DNA沉淀2次，12000rpm、4℃離心3min。D.3加入等體積酚:氯仿:異戊醇(D.5取上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇（-20℃),沉淀DNA，12000rpm、4℃離心2min。D.6加入1ml75%的冰乙醇（-20℃)洗滌DNA2次。立即插入相應(yīng)的點(diǎn)樣梳，將膠板水平放置，室溫靜置20-60min以待