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文檔簡介
ICS65.020
CCSB16
DB13
河北省地方標(biāo)準(zhǔn)
DB13/T5374—2021
禽煙曲霉菌病綜合診斷技術(shù)規(guī)程
2021-04-26發(fā)布2021-05-26實施
河北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布
DB13/T5374—2021
禽煙曲霉菌病綜合診斷技術(shù)規(guī)程
1范圍
本文件規(guī)定了禽煙曲霉病綜合診斷技術(shù)的臨床診斷、實驗室診斷和綜合判定。
本文件適用于雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等禽類煙曲霉菌病的診斷及其煙曲霉菌病原的檢測。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文
件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適
用于本文件。
GB19489-2008實驗室生物安全通用要求
3縮略語
下列縮略語適用于本文件。
GMA-Grocott:六胺銀染色;
PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);
PDA:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基;
PAS:過碘酸雪夫氏染色;
SYBRGreenⅠ:DNA熒光染料;
TTC:紅四氮唑顯色培養(yǎng)基;
TSA:胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基;
YEPD:酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基。
4臨床診斷
當(dāng)禽出現(xiàn)以下部分或全部情形時,可作為初步診斷的依據(jù)。
4.1臨床癥狀
各日齡禽均可感染,雛禽易感。病禽眼神呆滯、瞇眼、呼吸困難等癥狀。
4.2剖檢病變
肺臟發(fā)生不同程度壞死、氣囊增厚、出現(xiàn)黃色菌斑并偶而伴有肝臟出血斑或顏色暗紅。
5實驗室診斷
包括常規(guī)檢測和定量PCR檢測技術(shù)。參照GB19489-2008實驗室生物安全通用要求的相關(guān)條款。
1
DB13/T5374—2021
5.1常規(guī)檢測
5.1.1樣品的采集
取病禽肺、肝臟、腎等病料,放入無菌的平皿中;其他器官用無菌剪刀各取小塊組織兩份,用滅
菌水充分沖洗后,一份接種于YEPD平板上(1%酵母膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖,2%瓊脂粉),一份
放入40g/L甲醛固定液中待用。
5.1.2病原菌的分離純化與形態(tài)觀察
將接種病料的平板放入培養(yǎng)箱,28℃恒溫培養(yǎng),每天觀察菌落生長情況;3d后用接種環(huán)挑取平板
上的疑似菌落,劃線接種于YEPD平板培養(yǎng)基繼續(xù)分離培養(yǎng),3d后將疑似單菌落進(jìn)行涂片、染色和鏡檢,
取疑似菌落菌體進(jìn)一步接種于PDA試管斜面,28℃培養(yǎng)3d后保存?zhèn)溆谩?/p>
對照煙曲霉菌典型菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒別(參見附錄A)。
5.1.3組織切片檢查
將40g/L甲醛固定液中樣本固定24h后取出,經(jīng)修塊、脫水、透明、浸蠟包埋、切片、HE染色、PAS、
GMA和CFW染色,顯微鏡觀察組織病理和病原生長情況(參見附錄A)。
以病料中檢查到菌絲或孢子為陽性結(jié)果,病料中連續(xù)兩次檢查不到菌絲和孢子為陰性。
5.1.4不同染色方法檢查
分離株(經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定),進(jìn)行雞體攻毒試驗。并對HE、PAS、GMS、CFW四種染色方
法進(jìn)行了組織學(xué)對比觀察(參見附錄A)。
5.1.5CSP基因分型
分離株(經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定),進(jìn)行CSP基因分型,已確定感染煙曲霉菌的基因型(參見
附錄A)。
5.2定量PCR檢測
5.2.1樣品采集
選擇有典型癥狀的病禽,無菌采血或病變組織(肺),放入1.5mL滅菌EP管中,將EP管編號,記
錄樣本信息,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
5.2.2基因組DNA提取
取組織樣本0.2g放在研缽中,加入適量液氮,待液氮即將揮發(fā)殆盡時迅速研磨成粉末狀,收集樣
本0.05g~0.1g于1.5mLEP管中,加入500μL裂解液(400mMTris-HCl[pH8.0],60mMEDTA[pH8.0],
150mMNaCl,1%sodiumdodecylsulfate),室溫放置10min;加150μL乙酸鉀(pH4.8),漩渦震蕩,
離心12000g,1min,取上清液放入新試管,加入等體積異丙醇;DNA團(tuán)塊用70%乙醇清洗,干燥后,溶
解在50μLTE(10mMTris,1mMEDTA)中保存。
5.2.3引物合成
參照GenBank中煙曲霉benAfum基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(AFUA_1G10910),使用PrimerExpress5.0
軟件設(shè)計特異性引物(預(yù)期擴(kuò)增片段大小152bp):
上游引物F:5?-TAATAGCTACAATGGCTCCT-3?
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下游引物R:5?-ACGAGGAACATATTTGTCA-3?
5.2.4定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序
采用25μL的反應(yīng)體系:SYBRPremixExTaq(2×)12.5μL,上、下游引物各0.5μL,DNA模
板1.0μL,用雙蒸水補足至25μL。反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性3min;94℃30s,60℃30s,72℃
30s,進(jìn)行35個循環(huán),72℃延伸10min,于4℃終止反應(yīng)。
5.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線
從煙曲霉菌106-100copies/μL一系列模板特異性克隆的SYBRGreenⅠqPCR反應(yīng)熒光曲線可見,
在106-101copies/μL濃度范圍內(nèi)熒光曲線呈“S”形。以線性范圍內(nèi)6個濃度(106-101copies/μL)的特異
性克隆為模板在同樣條件下進(jìn)行SYBRGreenqPCR反應(yīng),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。
5.2.6結(jié)果判斷
當(dāng)待測樣品實時熒光定量PCR檢測結(jié)果有“S”型擴(kuò)增曲線,Ct值≤36.5,且Tm值為85℃時,判定待測
樣品中含有煙曲霉菌,而且可通過Ct值大小判斷感染的程度(參見附錄A)。未出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線
和Tm值,則判斷樣品中不含煙曲霉菌。
6綜合判定
結(jié)合臨床診斷、實驗室檢測結(jié)果,可確診禽煙曲霉菌病。
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AA
附錄A
(資料性)
菌落形態(tài)和菌絲及孢子形態(tài)特征
A.1鏡檢
將每個取樣EP管封蓋,瞬時振蕩,用無菌棉簽沾取懸液于YEPD慶大霉素培養(yǎng)基平板涂劃接種,于
28℃恒溫培養(yǎng)36h~48h;將疑似單菌落取菌體經(jīng)革蘭氏染色和棉藍(lán)染色鏡檢,將霉菌樣細(xì)胞的相應(yīng)
菌落取菌體分別接種于沙保弱培養(yǎng)基平板,于28℃恒溫、保濕培養(yǎng)3d~4d,觀察平板菌落特征并直
接鏡檢載片培養(yǎng)物形態(tài)特征。
A.2判斷
沙保弱培養(yǎng)基平板上可見中央為藍(lán)綠色,周圍為白色的菌落,但藍(lán)綠色占比多于周圍白色面積,
菌落背面,周邊為黃綠色,中央為藍(lán)綠色。第四天菌落正面分為三種顏色,由內(nèi)向外分別為墨綠、藍(lán)
綠、白色,而菌落周邊仍為白色。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌絲呈棉花樣,分生孢子頭的頂囊為倒立燒瓶狀。
孢子梗為單層小梗,小梗排列成木柵狀,小梗覆蓋頂囊表面的3/4。小梗的頂端分散著鏈狀的分生孢子,
分生孢子呈球形,成綠色或深綠色。
A.3不同染色方法檢查
HE染色:血管充血,呼吸毛細(xì)管消失,肺房間隔增寬甚至消失,被結(jié)締組織所取代,并有炎性細(xì)
胞浸潤。嚴(yán)重者,可看到孢子染成紅色,菌絲染成藍(lán)紫色,周圍組成為紅色,反差明顯;PAS染色:組
織結(jié)構(gòu)不清楚,菌絲染成紫色,孢子染成紅色,而背景為藍(lán)紫色,真菌與周圍組織反差明顯。菌絲短
而細(xì),且分支分隔,呈紅紫色,孢子為圓形,紅粉色。GMS染色:菌絲被染成黑褐色,背景為紅褐色,
反差明顯易辨認(rèn)。菌絲
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