DB13-T5374-2021禽煙曲霉菌病綜合診斷技術(shù)規(guī)程

ICS65.020

CCSB16

DB13

河北省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB13/T5374—2021

禽煙曲霉菌病綜合診斷技術(shù)規(guī)程

2021-04-26發(fā)布2021-05-26實施

河北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB13/T5374—2021

禽煙曲霉菌病綜合診斷技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了禽煙曲霉病綜合診斷技術(shù)的臨床診斷、實驗室診斷和綜合判定。

本文件適用于雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等禽類煙曲霉菌病的診斷及其煙曲霉菌病原的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

GB19489-2008實驗室生物安全通用要求

3縮略語

下列縮略語適用于本文件。

GMA-Grocott：六胺銀染色；

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；

PDA：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；

PAS：過碘酸雪夫氏染色；

SYBRGreenⅠ：DNA熒光染料；

TTC：紅四氮唑顯色培養(yǎng)基；

TSA：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基；

YEPD：酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基。

4臨床診斷

當(dāng)禽出現(xiàn)以下部分或全部情形時，可作為初步診斷的依據(jù)。

4.1臨床癥狀

各日齡禽均可感染，雛禽易感。病禽眼神呆滯、瞇眼、呼吸困難等癥狀。

4.2剖檢病變

肺臟發(fā)生不同程度壞死、氣囊增厚、出現(xiàn)黃色菌斑并偶而伴有肝臟出血斑或顏色暗紅。

5實驗室診斷

包括常規(guī)檢測和定量PCR檢測技術(shù)。參照GB19489-2008實驗室生物安全通用要求的相關(guān)條款。

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DB13/T5374—2021

5.1常規(guī)檢測

5.1.1樣品的采集

取病禽肺、肝臟、腎等病料，放入無菌的平皿中；其他器官用無菌剪刀各取小塊組織兩份，用滅

菌水充分沖洗后，一份接種于YEPD平板上（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉），一份

放入40g/L甲醛固定液中待用。

5.1.2病原菌的分離純化與形態(tài)觀察

將接種病料的平板放入培養(yǎng)箱，28℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況；3d后用接種環(huán)挑取平板

上的疑似菌落，劃線接種于YEPD平板培養(yǎng)基繼續(xù)分離培養(yǎng)，3d后將疑似單菌落進(jìn)行涂片、染色和鏡檢，

取疑似菌落菌體進(jìn)一步接種于PDA試管斜面，28℃培養(yǎng)3d后保存?zhèn)溆谩?/p>

對照煙曲霉菌典型菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒別（參見附錄A）。

5.1.3組織切片檢查

將40g/L甲醛固定液中樣本固定24h后取出，經(jīng)修塊、脫水、透明、浸蠟包埋、切片、HE染色、PAS、

GMA和CFW染色，顯微鏡觀察組織病理和病原生長情況（參見附錄A）。

以病料中檢查到菌絲或孢子為陽性結(jié)果，病料中連續(xù)兩次檢查不到菌絲和孢子為陰性。

5.1.4不同染色方法檢查

分離株（經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定），進(jìn)行雞體攻毒試驗。并對HE、PAS、GMS、CFW四種染色方

法進(jìn)行了組織學(xué)對比觀察（參見附錄A）。

5.1.5CSP基因分型

分離株（經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定），進(jìn)行CSP基因分型，已確定感染煙曲霉菌的基因型（參見

附錄A）。

5.2定量PCR檢測

5.2.1樣品采集

選擇有典型癥狀的病禽，無菌采血或病變組織（肺），放入1.5mL滅菌EP管中，將EP管編號，記

錄樣本信息，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2.2基因組DNA提取

取組織樣本0.2g放在研缽中，加入適量液氮，待液氮即將揮發(fā)殆盡時迅速研磨成粉末狀，收集樣

本0.05g～0.1g于1.5mLEP管中，加入500μL裂解液（400mMTris-HCl[pH8.0]，60mMEDTA[pH8.0]，

150mMNaCl，1%sodiumdodecylsulfate），室溫放置10min；加150μL乙酸鉀(pH4.8)，漩渦震蕩，

離心12000g，1min，取上清液放入新試管，加入等體積異丙醇；DNA團(tuán)塊用70%乙醇清洗，干燥后，溶

解在50μLTE（10mMTris，1mMEDTA）中保存。

5.2.3引物合成

參照GenBank中煙曲霉benAfum基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（AFUA_1G10910），使用PrimerExpress5.0

軟件設(shè)計特異性引物（預(yù)期擴(kuò)增片段大小152bp）：

上游引物F：5?-TAATAGCTACAATGGCTCCT-3?

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下游引物R：5?-ACGAGGAACATATTTGTCA-3?

5.2.4定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

采用25μL的反應(yīng)體系：SYBRPremixExTaq（2×）12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模

板1.0μL，用雙蒸水補足至25μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃30s，60℃30s，72℃

30s，進(jìn)行35個循環(huán)，72℃延伸10min，于4℃終止反應(yīng)。

5.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線

從煙曲霉菌106-100copies/μL一系列模板特異性克隆的SYBRGreenⅠqPCR反應(yīng)熒光曲線可見，

在106-101copies/μL濃度范圍內(nèi)熒光曲線呈“S”形。以線性范圍內(nèi)6個濃度（106-101copies/μL）的特異

性克隆為模板在同樣條件下進(jìn)行SYBRGreenqPCR反應(yīng)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。

5.2.6結(jié)果判斷

當(dāng)待測樣品實時熒光定量PCR檢測結(jié)果有“S”型擴(kuò)增曲線，Ct值≤36.5，且Tm值為85℃時，判定待測

樣品中含有煙曲霉菌，而且可通過Ct值大小判斷感染的程度（參見附錄A）。未出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線

和Tm值，則判斷樣品中不含煙曲霉菌。

6綜合判定

結(jié)合臨床診斷、實驗室檢測結(jié)果，可確診禽煙曲霉菌病。

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AA

附錄A

（資料性）

菌落形態(tài)和菌絲及孢子形態(tài)特征

A.1鏡檢

將每個取樣EP管封蓋，瞬時振蕩，用無菌棉簽沾取懸液于YEPD慶大霉素培養(yǎng)基平板涂劃接種，于

28℃恒溫培養(yǎng)36h～48h；將疑似單菌落取菌體經(jīng)革蘭氏染色和棉藍(lán)染色鏡檢，將霉菌樣細(xì)胞的相應(yīng)

菌落取菌體分別接種于沙保弱培養(yǎng)基平板，于28℃恒溫、保濕培養(yǎng)3d～4d，觀察平板菌落特征并直

接鏡檢載片培養(yǎng)物形態(tài)特征。

A.2判斷

沙保弱培養(yǎng)基平板上可見中央為藍(lán)綠色，周圍為白色的菌落，但藍(lán)綠色占比多于周圍白色面積，

菌落背面，周邊為黃綠色，中央為藍(lán)綠色。第四天菌落正面分為三種顏色，由內(nèi)向外分別為墨綠、藍(lán)

綠、白色，而菌落周邊仍為白色。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌絲呈棉花樣，分生孢子頭的頂囊為倒立燒瓶狀。

孢子梗為單層小梗，小梗排列成木柵狀，小梗覆蓋頂囊表面的3/4。小梗的頂端分散著鏈狀的分生孢子，

分生孢子呈球形，成綠色或深綠色。

A.3不同染色方法檢查

HE染色：血管充血，呼吸毛細(xì)管消失，肺房間隔增寬甚至消失，被結(jié)締組織所取代，并有炎性細(xì)

胞浸潤。嚴(yán)重者，可看到孢子染成紅色，菌絲染成藍(lán)紫色，周圍組成為紅色，反差明顯；PAS染色：組

織結(jié)構(gòu)不清楚，菌絲染成紫色，孢子染成紅色，而背景為藍(lán)紫色，真菌與周圍組織反差明顯。菌絲短

而細(xì)，且分支分隔，呈紅紫色，孢子為圓形，紅粉色。GMS染色：菌絲被染成黑褐色，背景為紅褐色，

反差明顯易辨認(rèn)。菌絲