結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（Granule-boundstarchsynthase，GBSS，EC1）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。CheKine?結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）可檢測(cè)植物組織樣本。在該試劑盒中，GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng)，將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP；進(jìn)一步通過(guò)反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應(yīng)生成的ADP數(shù)量呈正比，通過(guò)340nm下測(cè)定NADPH的增加量，可以計(jì)算GBSS活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計(jì)（能測(cè)340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：ExtractionBuffer有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。WorkingReagentII：臨用前配制；ReagentIIA48T加入8.4mLReagentⅠ，96T加入16.8mLReagentⅠ，緩慢加熱，逐漸升溫至煮沸使其溶解，冷卻后與ReagentIIB和ReagentIIC混勻溶解待用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。ReagentIII：臨用前配制；48T加入4.8mLReagentⅠ，96T加入9.6mLReagentⅠ，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。ReagentIV：臨用前配制；48T加入6mLReagentⅠ，96T加入12mLReagentⅠ，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。ReagentV：臨用前配制；48T加入0.225mL去離子水，96T加入0.45mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。ReagentVI：臨用前配制；48T加入0.225mL去離子水，96T加入0.45mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。測(cè)定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，棄上清液，在沉淀中加入1mLExtractionBuffer充分混勻，置冰上待測(cè)。注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3002的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm，紫外光分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在1.5mLEP管中操作）：試劑測(cè)定孔（μL）樣本75WorkingReagentII135混勻，30℃保溫20min，置沸水浴中1min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻ReagentIII75混勻，30℃保溫30min，置沸水浴中1min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10,000g，4℃離心10min，取上清液。下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作：上清液150ReagentIV100ReagentV5ReagentVI5充分混勻，立即記錄340nm處10s時(shí)吸光值A(chǔ)1和130s時(shí)的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算ΔA=A2-A1。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.02可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于0.6，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。若ΔA出現(xiàn)負(fù)值，則說(shuō)明樣本中不含GBSS或已降解。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。GBSS活性的計(jì)算使用96孔UV板測(cè)定的計(jì)算公式如下按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活單位定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。GBSS(U/mgprot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T×1.9=1,059×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：酶活單位定義：每克樣本每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。GBSS(U/g鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1.9=1,059×ΔA÷WV反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×10-4L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.075mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；1.9：稀釋倍數(shù)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式將上述計(jì)算公式中光徑d：0.5cm調(diào)整為d：1cm進(jìn)行計(jì)算即可。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。Figure1.本試劑盒測(cè)定南瓜和玉米種子中GBSS的活性。相關(guān)產(chǎn)品Catalog