活性氧（ROS）含量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

活性氧（ROS）含量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中起重要作用。但是，在氧化應(yīng)激相關(guān)狀態(tài)下，ROS水平可以大大增加。ROS的積累會(huì)嚴(yán)重破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。氧化應(yīng)激在心血管疾病，糖尿病，骨質(zhì)疏松癥，中風(fēng)，炎癥性疾病，以及神經(jīng)退行性疾病和癌癥的研究發(fā)揮重要的作用。ROS檢測(cè)將有助于確定氧化應(yīng)激如何調(diào)節(jié)各種細(xì)胞內(nèi)途徑。CheKine?活性氧（ROS）含量檢測(cè)試劑盒（熒光法）提供了一種簡(jiǎn)單、靈敏、快速的ROS檢測(cè)方法，其原理是利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)，DCFH-DA(二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯)可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解，形成DCFH，DCFH無熒光且不能通透細(xì)胞膜，其可以被細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）氧化生成有熒光的DCF，使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)和觀察活細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光信號(hào)強(qiáng)度，即可以分析細(xì)胞活性氧的水平。自備耗材·流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡·無血清培養(yǎng)基、PBS·37℃恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱·離心管·可調(diào)式移液槍及槍頭·6孔板實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)于刺激時(shí)間較短（通常為2h以內(nèi)）的細(xì)胞，建議先裝載探針，后用活性氧陽性對(duì)照或感興趣的藥物刺激細(xì)胞；對(duì)于需要較長(zhǎng)時(shí)間刺激（通常為6h以上）的細(xì)胞，建議先用活性氧陽性對(duì)照或感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針，此處僅提供后者的實(shí)驗(yàn)方法，具體步驟如下：原位裝載探針(僅適用于貼壁細(xì)胞)a)細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測(cè)前一天細(xì)胞鋪板，確保檢測(cè)時(shí)細(xì)胞數(shù)量小于5×105個(gè)/mL。b)藥物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的藥物處理細(xì)胞，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)藥物特性和細(xì)胞類型決定。c)（選做）陽性對(duì)照：用無血清培養(yǎng)液稀釋PositiveControl(50mM)到常用工作濃度50μM，加入細(xì)胞，37℃避光孵育30min-4h。為提高活性氧水平，不同類型細(xì)胞刺激時(shí)間存在差異，例如：HeLa細(xì)胞需處理30-60min。注意：（1）僅在陽性對(duì)照孔中加入，其余試驗(yàn)組不需要加陽性對(duì)照。（2）陽性對(duì)照推薦初始使用濃度為50μM（推薦濃度50-250μM，具體依細(xì)胞類型而定），工作液要現(xiàn)用現(xiàn)配，不要儲(chǔ)存稀釋后的溶液，陽性對(duì)照也可用不含酚紅的10%FBS完全培養(yǎng)基稀釋。d)ROS探針準(zhǔn)備：用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。e)ROS探針裝載：去除處理藥物，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2次，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液。需充分蓋住細(xì)胞，例如：6孔板通常不少于1mL/孔，96孔板通常不少于100μL/孔，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30min。f)細(xì)胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。收集細(xì)胞后裝載探針(適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞)a)細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測(cè)用細(xì)胞狀態(tài)良好。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。b)藥物誘導(dǎo)：將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間可根據(jù)藥物特性和細(xì)胞類型決定。c)（選做）陽性對(duì)照：用無血清培養(yǎng)液稀釋PositiveControl(50mM)到常用工作濃度50μM，加入細(xì)胞，37℃避光孵育30min-4h。為提高活性氧水平，不同類型細(xì)胞刺激時(shí)間存在差異，例如：HeLa細(xì)胞需處理30-60min。注意：（1）僅在陽性對(duì)照孔中加入，其余試驗(yàn)組不需要加陽性對(duì)照。（2）陽性對(duì)照推薦初始使用濃度為50μM（推薦濃度50-250μM，具體依細(xì)胞類型而定），工作液要現(xiàn)用現(xiàn)配，不要儲(chǔ)存稀釋后的溶液，陽性對(duì)照也可用不含酚紅的10%FBS完全培養(yǎng)基稀釋。d)ROS探針準(zhǔn)備：探針裝載前，用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。e)ROS探針裝載：離心收集細(xì)胞去除處理藥物，并用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2次，離心收集細(xì)胞，加入稀釋好的探針，使其細(xì)胞密度為1.0×106-2.0×107，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30min。注意：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測(cè)體系，檢測(cè)方法以及檢測(cè)總量來進(jìn)行調(diào)整。例如：對(duì)于流式分析，單管檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。f)細(xì)胞清洗：用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。熒光顯微拍照a)對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞（步驟1.f)，細(xì)胞清洗后，加適量的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液或PBS，在熒光顯微鏡下觀察；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞（步驟2.f)，取25-50μL細(xì)胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。b)熒光顯微鏡下，選用FITC濾光片觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。流式細(xì)胞分析操作方法a)對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞（步驟1.f)，用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞（步驟2.f)，直接收集細(xì)胞。用0.5-1mLPBS重懸細(xì)胞(0.5-1x105/mL)；b)流式細(xì)胞儀中，488nm為激發(fā)波長(zhǎng)，525nm為發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。注意事項(xiàng)陽性對(duì)照推薦初始使用濃度為50μM（推薦濃度50-250μM，具體依細(xì)胞類型而定）。通常刺激后30min-4h可以觀察到顯著的活性氧水平升高。對(duì)于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對(duì)照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30min內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)提高活性氧陽性對(duì)照的濃度。如果熒光信號(hào)過強(qiáng)，可縮短誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)降低活性氧陽性對(duì)照的濃度。實(shí)驗(yàn)過程中，如果陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1:2,000-1:5,000稀釋熒光探針DCFH-DA，使DCFH-DA的終濃度為2-5μM。探針裝載的時(shí)間可在15-60min內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整，盡量縮短讀片時(shí)的曝光時(shí)間，并且試驗(yàn)組、對(duì)照組曝光時(shí)間需保持一致。PositiveControl(50mM)僅僅用于作為陽性對(duì)照的樣品，并非所有試驗(yàn)組樣品中都需加入活性氧陽性對(duì)照。探針裝載后，一定要洗凈未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。盡量縮短探針裝載后到檢測(cè)所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1030CheKine?超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）KTB1040CheKine?過氧化氫酶(