還原型谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒實驗解決方案

還原型谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒實驗解決方案原理谷胱甘肽是甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸組成的天然三肽。在紅細胞中，還原型谷胱甘肽是維持血紅蛋白處于還原狀態(tài)的關(guān)鍵，保護細胞免受氧化損傷。GSH是細胞中最重要的抗氧化劑巰基化合物，在細胞抗氧化、蛋白質(zhì)巰基保護和氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運中起重要作用。還原型與氧化型比值（GSH/GSSG）是細胞氧化還原狀態(tài)的主要動態(tài)指標。測定細胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態(tài)。CheKine?還原型谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（微量法）提供了一種簡單的檢測方法，用于檢測生物樣本，如血清（漿）、動植物組織、血細胞、細胞及細菌中GSH的含量。DTNB與還原型谷胱甘肽反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物。在412nm處有最大光吸收，與樣品中還原型谷胱甘肽的濃度成正比。自備耗材·酶標儀或可見光分光光度計（能測412nm處的吸光度）·水浴鍋·96孔板或微量玻璃比色皿，可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·低溫離心機·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。Chromogen：即用型；4℃避光保存。標準品制備：DilutedExtractionBuffer：ExtractionBuffer用去離子水稀釋10倍。取200μLExtractionBuffer加入1,800μL去離子水，DilutedExtractionBuffer用于稀釋標準品。10mg/mLGSH標準品：每管用1mL去離子水溶解得10mg/mLGSH標準品，分裝后-20℃，避光保存1個月。標準品制備：使用10mg/mLGSH標準品，按照下表所示，進一步稀釋標準品：序號Standard(μL)DilutedExtractionBuffer(μL)Concentration(μg/mL)Std.140μLof10mg/mLGSH960400Std.2100μLofStd.1(400μg/mL)100200Std.3100μLofStd.2(200μg/mL)100100Std.4100μLofStd.3(100μg/mL)10050Std.5100μLofStd.4(50μg/mL)10025Std.6100μLofStd.5(25μg/mL)10012.5Std.7100μLofStd.6(12.5μg/mL)1006.25注意：每次實驗，請使用新配制的標準品；配制好的標準品需要在4h之內(nèi)使用。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。處理好的樣本須當天檢測。測定過程中樣本在冰上放置，以免變性和失活。動物組織：稱取0.1g組織樣本，加入1mL預(yù)冷的ExtractionBuffer，快速冰上勻漿。勻漿后的樣本，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。植物組織：稱取0.1g植物組織，加入1mL預(yù)冷的ExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次）。超聲后的樣本，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清或血漿：將收集的抗凝血于600g，4℃離心10min，30min內(nèi)吸取上層血漿到另一支試管中，加入等體積的ExtractionBuffer，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血細胞：將收集的抗凝血于600g，4℃離心10min，棄去上層血漿用3倍體積的PBS清洗3次（用PBS重懸血細胞，600g，4℃離心10min），加入等體積ExtractionBuffer，混勻后4℃放置10min，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細胞或細菌：收集2×106個細胞（菌），首先用冷PBS清洗細胞（菌）2次（用PBS重懸，600g，4℃離心10min），加入3倍細胞（菌）沉淀體積的ExtractionBuffer重懸，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），8,000g，4℃離心10min，取上清液做進一步分析。注意：該試劑盒提取的樣本也適用于氧化型谷胱甘肽（KTB1610）的檢測。因ExtractionBuffer中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取相同樣本，把ExtractionBuffer換成去離子水提取制備。如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟酶標儀或可見光分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，可見光分光光度計用去離子水調(diào)零。在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加樣：試劑空白孔（μL）標準孔（μL）測定孔（μL）Sample0020去離子水2000Std.0200AssayBuffer140140140Chromogen404040充分混勻，室溫避光孵育2min，記錄412nm處吸光度值A(chǔ)空、A標、A測。所有孔測定的吸光度A值減去空白孔的吸光度A空，即ΔA標=A標-A空，ΔA測=A測-A空。注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本的ΔA測高于400μg/mL標準品的ΔA標，將樣本用去離子水進一步稀釋，乘以最終的稀釋倍數(shù)，如果ΔA測低于0.01，可增加樣本量。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。標準曲線的繪制以標準品濃度為y軸，ΔA標為x軸，繪制標準曲線。將ΔA測代入方程得到y(tǒng)值（μg/mL），還原型谷胱甘肽含量(μg/mL)=y。含量計算按樣本質(zhì)量計算GSH含量(μg/g質(zhì)量)=y×V樣÷(V樣÷V提取×W)×n=y÷W×n按蛋白濃度計算GSH含量(μg/mgprot)=y×V樣÷(V樣×Cpr)×n=y÷Cpr×n按細菌或細胞數(shù)量計算GSH含量(nmol/104)=y÷(數(shù)量÷V提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n按液體體積計算GSH含量(nmol/mL)=y×2×nW：樣本質(zhì)量，g；V樣：加入樣本的體積，2μL；V提?。杭尤隕xtraction

Buffer體積，1mL；n：樣本的稀釋倍數(shù)；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬個；2：提取液體時稀釋一倍。結(jié)果展示典型標準曲線：Figure1.96孔板分析的GSH標準曲線。數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標準曲線。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB