二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶（Rubisco）檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco,EC9）是植物光合作用中的一個關(guān)鍵酶，既控制著CO2的固定，同時又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性直接影響著光合速率。CheKine?二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）檢測試劑盒（微量法）可檢測植物組織樣本的Rubisco的活性，其原理是在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）與1分子的CO2結(jié)合，產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）；PGA可通過外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，伴隨著NADH氧化生成NAD+；在340nmNADH有特征吸收峰，而NAD+沒有此吸收峰，測定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·制冰機(jī)、低溫離心機(jī)、水浴鍋·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBufferⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ExtractionBufferⅡ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。WorkingReagentⅡ：臨用前配制，對于48T，加5.5mLReagentⅠ溶解；對于96T，加11mLReagentⅠ溶解，混勻備用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。WorkingReagentⅢ：臨用前配制，對于48T，加5.5mLReagentⅠ溶解；對于96T，加11mLReagentⅠ溶解，混勻備用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。WorkingReagentⅣ：臨用前配制，對于48T，加0.6mLReagentⅠ溶解；對于96T，加1.2mLReagentⅠ溶解，混勻備用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。WorkingSolution：臨用前將WorkingReagentⅡ和WorkingReagentⅢ按1:1混合，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配制相應(yīng)的體積?，F(xiàn)用現(xiàn)配。樣本制備粗酶液制備：1.總Rubisco酶提?。悍Q取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBufferⅠ，冰浴勻漿，超聲波破碎1min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s），8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。2.胞漿和葉綠體Rubisco酶的分離：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBufferⅠ，冰浴勻漿，200g，4℃離心5min，棄沉淀，取上清，8,000g，4℃離心10min，離心后取上清用于測定胞漿Rubisco酶活性，取沉淀加1mLExtractionBufferⅡ，震蕩溶解后超聲破碎1min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s），8,000g，4℃離心10min，取上清測定葉綠體中Rubisco酶活性。注意：建議測定總Rubisco酶活性，按照步驟1提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的Rubisco，則按照步驟2提取粗酶液。如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實(shí)驗(yàn)步驟1.酶標(biāo)儀或紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，紫外分光光度計用去離子水調(diào)零。2.操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作）：試劑空白孔（μL）測定孔（μL）樣本010去離子水100WorkingReagentⅣ1010WorkingSolution1801803.迅速混勻后于340nm檢測，記錄20s和5min20s的吸光值，測定孔的記為A1和A2，空白孔的記為A3和A4，計算ΔA測=(A1-A2)-(A3-A4)。注意：空白孔只需測定1次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA測小于0.01可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA測大于0.6，樣本可用對應(yīng)的ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。A.使用96孔UV板測定的計算公式(1)按樣本蛋白濃度計算單位的定義：25℃中，每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmolNADH氧化定義為一個酶活力單位。Rubisco(U/mgprot)=[ΔA測×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣本×Cpr)÷T=1,286×ΔA測÷Cpr(2)按樣本質(zhì)量計算單位的定義：25℃中，每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmolNADH氧化定義為一個酶活力單位。Rubisco(U/g質(zhì)量)=[ΔA測×V反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V樣本)÷T=1,286×ΔA測÷WV反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10-4L，V提?。禾崛∫后w積，1mL；V樣本：反應(yīng)體系中上清液體積，0.01mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板直徑，0.5cm；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；T：反應(yīng)時間，5min；W：樣本質(zhì)量，g。使用微量石英比色皿進(jìn)行測定的計算公式將上述計算公式中光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進(jìn)行計算即可。結(jié)果展示稱取0.1g擬南芥葉片加入1mLExtractionBufferⅠ進(jìn)行勻漿研磨，取上清，之后按照測定步驟操作，用96孔UV板測得：A1=0.918，A2=0.842，A3=0.863，A4=0.863，ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)=(0.918-0.842)-(0.863-0.863)=0.076，按樣本質(zhì)量計算酶活得：Rubisco(U/g質(zhì)量)=1,286×ΔA÷W=1,286×0.076÷0.1=977.36U/g。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1020CheKine?