RNA病毒檢測簡述培訓(xùn)課件

RT-PCR原理提取總RNA以其中的mRNA作為模板

反轉(zhuǎn)錄cDNAPCR作模板獲得目的基因1RNA病毒檢測簡述1/22/2025一、RNA的提取RNA易降解，在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性。RNA酶穩(wěn)定，并廣泛存在，如各種組織、人的皮膚、手指、試劑、容器等。2RNA病毒檢測簡述1/22/2025采取的措施：1、全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。2、所用的玻璃器皿需置于干熱滅菌箱中200℃烘烤2h以上。3、不能用高溫烘烤的材料，如塑料容器、試劑等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理，然后高壓滅菌以消除殘存的DEPC。

3RNA病毒檢測簡述1/22/2025注意事項：1、DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物。2、DEPC能與氨基和巰基反應(yīng)，因而含Tris和DTT（二硫蘇糖醇）的試劑不能用DEPC處理。3、Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。4、配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。

4RNA病毒檢測簡述1/22/2025總RNA提取方法（試劑盒）：異硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）原理：（1）Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚是有效的蛋白變性劑，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。

異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。5RNA病毒檢測簡述1/22/2025（2）氯仿可使蛋白變性，降低蛋白的溶解度。其主要作用是分相，實際上是加速有機相和水相的分層。上層水相，pH5.1左右，當(dāng)溶液pH在酸性的時候，DNA分子就會沉淀在酚與溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而當(dāng)pH接近中性時，DNA就會溶解在水相，（導(dǎo)致pH中性的原因可能是trizol與樣品比例不對，應(yīng)該盡量保證提取量的前提下使trizol過量）。同時，氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。6RNA病毒檢測簡述1/22/2025（3）異丙醇作用是沉淀RNA。異丙醇沉淀，優(yōu)點是容積小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，對5sRNA、tRNA不產(chǎn)生沉淀，所以RNA電泳的標(biāo)志性三條帶中5sRNA帶很不清楚，未必是你的RNA降解。但是異丙醇難以揮發(fā)出去。（4）因為上述試劑會影響后續(xù)實驗，所以用75%乙醇洗1-2次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的有機物雜質(zhì)；二是洗掉異丙醇、氯仿，乙醇易揮發(fā)，痕量的乙醇很容易揮發(fā)掉。7RNA病毒檢測簡述1/22/2025YeastTotalRNA8RNA病毒檢測簡述1/22/2025二、cDNA的合成反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶種類：兩種1、禽類成髓細(xì)胞病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個多肽亞基（最適溫度42℃）

活性：依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。9RNA病毒檢測簡述1/22/20252、鼠白血病病毒(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶

只有單個多肽亞基（最適溫度37℃）

活性：依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA雜交體中的RNA的能力較弱，且對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。

10RNA病毒檢測簡述1/22/2025cDNA引物種類：1、隨機引物：不特異的引物體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

11RNA病毒檢測簡述1/22/20252、Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的引物絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’-端Poly(A)尾，此引物（12-18核苷酸）與其配對，僅mRNA可被反轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機引物得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。

12RNA病毒檢測簡述1/22/20253、特異性引物

用含目標(biāo)RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴增。13RNA病毒檢測簡述1/22/2025第二章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（PCR）*PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）,是一種對特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴增的方法。

*由1985年穆里斯（K.Mullis）發(fā)明，他也因此獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎。14RNA病毒檢測簡述1/22/2025PCR的原理：體外DNA復(fù)制包括高溫變性、低溫退火和中溫延伸過程。15RNA病毒檢測簡述1/22/2025一、PCR基本步驟三個步驟：1、變性(Denature)：雙鏈DNA目的片段在94℃下解鏈。2、退火(Anneal)：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對。3、延伸(Extension)：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度(72℃左右)下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。

16RNA病毒檢測簡述1/22/2025二、PCR反應(yīng)中的主要成分引物：好壞是PCR成敗的關(guān)鍵。

設(shè)計原則：1、引物長度約為16-30bp。

2、引物中G+C含量通常為40%-60%，粗略估計引物的解鏈溫度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。

3、四種堿基應(yīng)隨機分布，在3'端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)引發(fā)錯誤。

17RNA病毒檢測簡述1/22/20254、引物3'-端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。5、在引物內(nèi)，尤其在3‘-端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)，且3’-端盡量不用A，尤應(yīng)避免連續(xù)2個或2個以上A，因為A引發(fā)錯配的幾率高；最好選擇T。18RNA病毒檢測簡述1/22/20256、兩引物之間尤其在3'-端不能互補，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。7、引物5'-端對擴增特異性影響不大，可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點等，通常應(yīng)在5'-端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。

19RNA病毒檢測簡述1/22/20258、引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補。引物濃度：一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。20RNA病毒檢測簡述1/22/20254種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。

21RNA病毒檢測簡述1/22/2025Mg2+：

Mg2+濃度對TaqDNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5-2mmol/L。對于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進(jìn)行預(yù)備實驗，選出最適的Mg2+濃度。

22RNA病毒檢測簡述1/22/2025在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團，例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg2+濃度。

模板：PCR中模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好)。23RNA病毒檢測簡述1/22/2025就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中模板量為102-105個拷貝。擴增單拷貝基因，需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA。多拷貝基因擴增用量更少。模板過多可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率。24RNA病毒檢測簡述1/22/2025TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期為92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃30min，摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率，一般PCR中出錯率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時尤應(yīng)注意。

25RNA病毒檢測簡述1/22/2025所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p。酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。反應(yīng)結(jié)束后，需要滅活TaqDNA聚合酶。滅活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR產(chǎn)物經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+

。(3)99-100℃加熱10min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。

26RNA病毒檢測簡述1/22/2025反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩