藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體課件

藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體

----ABC類載體藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體一、ABC類轉(zhuǎn)運體ATP結(jié)合盒(ATP-bindingcassette，ABC)類物質(zhì)外排轉(zhuǎn)運載體。這類轉(zhuǎn)載體轉(zhuǎn)運各種類型的底物如糖、氨基酸、金屬離子、多肽、蛋白質(zhì)以及各種脂溶性物質(zhì)外排式跨膜轉(zhuǎn)運。ABC類載體是許多生命過程必須的，缺陷可以引起多種疾病或與多種疾病有關(guān)如囊性纖維化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、視網(wǎng)膜變性、膽固醇和膽汁轉(zhuǎn)運缺失、貧血癥和藥物反應(yīng)異常等。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體特點：1。與ATP結(jié)合，利用ATP跨膜轉(zhuǎn)運物質(zhì)。底物分子轉(zhuǎn)運是單向的，通常是泵出細(xì)胞外。2。結(jié)構(gòu)上：ATP-結(jié)合域,稱之為核苷結(jié)合包(NBF)和跨膜(TM)域。該域一般由6個

-螺旋段組成。NBF含3個保守區(qū)域WalkerA、WalkerB和WalkerC。在WalkerA和B存在ATP結(jié)合點，而WalkerC為一簽名區(qū),位于WalkerB的上游，C區(qū)是相應(yīng)ABC載體特有性的。3。典型的ABC載體有兩個NBF和兩個TM域,NBF存在于胞漿側(cè)。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體發(fā)現(xiàn)48個ABC載體。這些基因根據(jù)區(qū)域的構(gòu)成和氨基酸的同組關(guān)系分成7個亞型。許多ABC載體在脂質(zhì)層的功能維持、脂肪酸轉(zhuǎn)運和類固醇類轉(zhuǎn)運方面有重要的作用。已發(fā)現(xiàn)14種與人類疾病相關(guān)的ABC基因藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體ABCC2（Abcc2）基因突變：與Dubin-Johnson綜合征有關(guān)。ABCC2蛋白存在于肝細(xì)胞的管側(cè)面膜上調(diào)節(jié)有機陰離子轉(zhuǎn)運。在多有機陰離子轉(zhuǎn)運載體（TR-）的缺陷的大鼠中，該大鼠已用作Dubin-Johnson綜合征的動物模型。

ABCB7基因的錯義與成高鐵紅細(xì)胞貧血癥和失調(diào)（XLSA/A）相關(guān)。

藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體CFTR蛋白為氯離子通道，與所有外分泌有關(guān)，缺陷導(dǎo)致膽囊纖維病變。ABCC8是磺酰脲受體，對磺酰脲藥物有高度的親和力。磺酰脲類藥物為治療非胰島素依賴性糖尿病，主要促進(jìn)胰島素的分泌。

ABCC8基因突變可能typeII糖尿病有關(guān)。

藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體二、多藥耐藥（藥物外排載體）所有ABC的外排在體均存在于細(xì)胞膜上，參與各種結(jié)構(gòu)類型的藥物、代謝物和化合物的外排。根據(jù)結(jié)構(gòu)類型，藥物外排載體分為四大類。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體ABC家族藥物轉(zhuǎn)運載體的預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。NBD,（ATP）核苷結(jié)合點,IN,細(xì)胞內(nèi),OUT細(xì)胞外

藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體藥物載體在極性細(xì)胞（包括組織內(nèi)皮或上皮細(xì)胞）中的定位。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體1.MDR1P-糖蛋白(MDR1P-glycoprotein)ABCB1.又稱為MDR1，P-GP或PGY1。

人MDR1MDR3藥物藥物，脂質(zhì)MDR基因MDR基因Mdr1a/mdr1bmdr2

藥物藥物，脂質(zhì)藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體P-GP有兩個相似和對稱的半載體組成,每個半載體有一個ATP結(jié)合點和6個TM域。兩個半載體只有43%氨基酸序列是一致的。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體先與ATP結(jié)合，再水解是藥物轉(zhuǎn)運必需的。,不同的底物轉(zhuǎn)運需要的ATP分子是不同的，每轉(zhuǎn)運一個藥物分子出細(xì)胞,需要0.3-3個分子的ATP。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體P-gp催化循環(huán).藥物和ATP與Pgp結(jié)合藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體P-GP轉(zhuǎn)運柔紅霉素(DNR)跨膜兩步過程。環(huán)孢素A(CsA),XR9576(XR)和長春堿(VL)在細(xì)胞漿側(cè)面阻斷,維拉帕米(VER)在細(xì)胞外側(cè)阻斷(優(yōu)先占領(lǐng)).藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體2.P-GP底物P-GP有各種類型的底物如秋水仙堿阿霉素、長春堿、脂質(zhì)、類固醇、化學(xué)異物和多肽等.似乎無共性．1）多數(shù)底物是兩性分子2)化合物脂溶性和氫鍵的數(shù)目決定底物與P-GP親和力的重要參數(shù)。脂溶性大或氫鍵數(shù)目多，P-GP的親和性高.電子供體基團間距離有一定范圍是識別P-GP結(jié)合點必需的，至少其中一個2.5±0.3?，另一個為4.6±0.6?

藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體MDR1P-GP抑制劑第一代P-GP抑制劑如維拉帕米、環(huán)孢素A第二代或第三代抑制劑PSC833,GF120918

藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體P-GP生理功能1)腫瘤細(xì)胞耐藥原因之一誘導(dǎo)性2）正常體內(nèi)：生理性屏障（腸上皮、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽小管上皮細(xì)胞、胎盤合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞）藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體1)血腦屏障在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞腔側(cè)面表達(dá)豐富的P-GP,成為許多藥物難以通過血腦屏障的原因;藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體一些疾病如癲癇誘導(dǎo)P-GP表達(dá),成為頑固性癲癇的原因之一炎癥下調(diào)P-GP表達(dá),導(dǎo)致血腦屏障的通透性顯著增加.藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體Fig.WesternblotshowedexpressionofP-gpfromthecerebralcortexofnormalratsandPTZ-kindledrats.n=3.(**p<0.01vsNormal)藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體Fig.P-gpfunctionalactivityinhippocampusandcerebralcortexofnormalratsandPTZ-kindledrats.Samplesof60minafterasingledoseof0.2mg/kgRh123.n=4.(*p<0.05,**p<0.01vsNormal)藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體Fig.DistributionofPBinbraintissuesofnormalrats,kindledratsandkindledratstreatedwithCsA(5mg/kg).Samplesof60minafterasingledoseof10mg/kgPB.Datawereexpressedasratiovaluesasmean±SD(n=4).(*p<0.05,**p<0.01vsnormalrats,#p<0.05,##p<0.01vskindledrats).藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體2)在肝-膽和腸中作用生物利用度的原因藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體(1)保護機制防止毒物由胃腸道進(jìn)入體內(nèi)。(2）腸上皮細(xì)胞中P-GP分泌功能成為許多藥物吸收差的原因之一,成為藥物口服吸收的障礙。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體野生型小鼠灌胃50mg/kg紫衫醇約有95%的藥物原型從糞中排泄.同時口服P-GP抑制劑環(huán)孢素A(50mg/kg),PSC833(50mg/kg),GF120918(25mg/kg),LY335979(80mg/kg)或R101933(80mg/kg),顯著降低糞中原型藥物的排謝分?jǐn)?shù)，分別為32.4%,12.5%,6.2%,34.9%和73.6%。在mdr1a/1b基因敲除小鼠，糞中原型排泄分?jǐn)?shù)只有6%。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體3)P-gP介導(dǎo)的藥物外排,符合載體轉(zhuǎn)運的特點，存在飽和特性某些底物的M-M常數(shù)藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體不同底物和劑量腸道P-GP的作用是不同的。A.地高辛通常劑量是0.5到1mg，腸內(nèi)的濃度不到10

mol/l，低于Km58

mol/l。P-Gp在吸收方面有重要的意義，可能是該藥物吸收程度地和變異大的主要原因。B.劑量大于50mg，腸內(nèi)藥物濃度達(dá)到mmol/l

水平，可能超過相應(yīng)藥物的Km值，P-GP的活性處于飽和，P-GP對藥物吸收的貢獻(xiàn)不大。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體Indinavir：P-GP的底物，劑量高達(dá)800mg，腸內(nèi)濃度超過1mmol/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Km140

mol/L，p-GP的作用對貢獻(xiàn)不大。仍然有好的生物利用度藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體C.一些藥物如環(huán)孢素（200–700mg）、紫杉醇（100–200mg），盡管劑量很高，由于這些藥物的溶解度和釋放度低，腸內(nèi)的濃度低于Km值，但P-GP對吸收的影響仍然很大。D.某些藥物吸收程度隨劑量增加而增加如(S)-(–)-talinolol計量校正的AUC由12.5mg劑量的18

g.h/l增加到200mg劑量的36

g.h/l。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體4)腸中P-GP也是機體重要保護機制之一，免受各種腸中毒素的侵害。如Mdr1a缺陷小鼠產(chǎn)生一種大腸炎癥，類似人類的腸內(nèi)部炎。正常情況下，腸中的P-GP阻止毒素進(jìn)入腸壁內(nèi).復(fù)雜性和注意問題:抑制胃腸道上P-GP功能,必然降低屏障功能,增加毒物(素)進(jìn)入體內(nèi)!藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體腸不同部位P-GP的表達(dá)不同.

圖6.人腸中不同部位P-gp和villinIODratio比值平均和變異.1/2代表十二指腸/近端空腸，3/4,5/6,和7/8分別代表中段至遠(yuǎn)端空腸，近端回腸支遠(yuǎn)端回腸。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體3)胎盤屏障

P-GP存在于胎盤合胞體滋養(yǎng)層頂側(cè)面膜。類似于血腦屏障，防止有毒物質(zhì)從母體進(jìn)入胎兒。在P-GP缺陷或基因敲除動物，avermectin,地高辛,saquinavir和紫杉醇通透性增加10–20倍。對于多數(shù)治療藥物而言，在胎盤上的低通透性當(dāng)然是需要的，但在有些情況下，成為治療上的障礙。如對于HIV治療，希望在嬰兒出生前，有一個合適的“負(fù)荷劑量”，降低在出生過程中母-嬰HIV感染的頻率藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)1.乳腺癌耐藥蛋白（breastcancerresistanceprotein,BCRP,ABCG2）。BCRP

只有一個NBF

和TM域，為半ABC載體。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體BCRPmRNA最早發(fā)現(xiàn)于胎盤中。BCRP首先是從乳腺癌細(xì)胞中分離得到的，稱之為乳腺癌耐藥蛋白。第一次在耐阿霉素的MCF7乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7/AdrVp)中克隆到BCRP。鼠類命名為Bcrp1BCRP是細(xì)胞株對絲裂霉素、阿霉素和柔紅霉素抗癌藥物等產(chǎn)生耐藥的主要原因。BCRP主要在細(xì)胞膜上，存在于細(xì)胞的頂側(cè)面上.藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體2.BCRP/Bcrp1介導(dǎo)的耐藥

BCRP的底物與P-GP,MRP1和MRP2的底物間有較大的重疊性

細(xì)胞株對絲裂霉素,拓樸替康,9-氨基喜樹堿,柔紅霉素,SN-38,flavopiridol,吲哚咔唑,拓樸酶抑制劑(NB-506和

J-107088),

細(xì)胞染料如羅丹明123,Lysotracker綠

,BBR3390以及熒光素-BODIPY-prazosin.對長春新堿,紫杉醇和順鉑等抗癌藥無耐藥性藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體不同藥物誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果往往存在差異。某些藥物誘導(dǎo)表達(dá)BCRP細(xì)胞株對蒽醌類有很高的耐藥性,而另一些藥物誘導(dǎo)BCRP表達(dá)的細(xì)胞株,相對絲裂霉素而言，則對蒽醌類幾乎沒有耐藥性。有些誘導(dǎo)表達(dá)BCRP細(xì)胞株對拓樸替康的耐藥性相當(dāng)高,但另一些誘導(dǎo)表達(dá)BCRP細(xì)胞株的耐藥很低藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體存在兩種突變株：野生型482位上的氨基酸為Arg兩種突變型:Thr和Gly。不同的BCRP對底物的作用不同。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體野生型與突變型比較

野生型突變型482位A

Arg

Thr或Gly底物葉酸及其衍生物

+-羅丹明123-+LysoTracker綠-+柔紅霉素-+絲裂霉素++bodipy-prazosin++Hoechst33342++抑制劑新生霉素+-藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體3.BCRP/Bcrp1抑制劑

（1）GF120918;P-GP抑制劑，也是有效的BCRP/Bcrp1抑制劑;抑制藥物外排泵BCRP和P-GP

（2）fumitremorginC(FTC),是有效的BCRP-抑制劑,但在體有神經(jīng)毒性，其中兩種類似物Ko132和

Ko134)活性比FTC大，Ko134細(xì)胞毒性很低，在體可以用很高劑量,可以顯著增加小鼠口服拓?fù)涮婵档纳锢枚取Ｋ幬锟缒まD(zhuǎn)運載體（3）某些HIV蛋白酶抑制劑強效的BCRP抑制劑.z在表達(dá)野生型BCRP的HEK細(xì)胞株中，ritonavir,saquinavir和nelfinavir是有效地抑制BCRP介導(dǎo)的絲裂霉素轉(zhuǎn)運，其IC50分別為19.5,19.5和12.5μmol/l。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體（4）植物酚類化合物：5,7-二羥黃酮(Chrysin)和biochaninA，silymarin,橙皮素（hesperetin）,櫟精（quercetin）,黃豆苷（daidzein）,stilbeneresveratrol。（5）香豆霉素抗生素：新生霉素

（6）酪氨酸激酶抑制劑：STI-571(imatinibmesylate),ZD1839(Iressa;gefitinib)和

N-[4-[(3-溴苯)胺]-6-喹唑啉]-2-丁胺

(EKI-785)藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體4.BCRP/Bcrp1組織分布

在人的胎盤中，BCRP

mRNA表達(dá)非常高，而在鼠類胎盤相對弱。

相反，在小鼠的腎臟表達(dá)最高，而在人的腎臟表達(dá)低表達(dá)。BCRP在胎盤合胞體滋養(yǎng)層膜的母體側(cè)、在肝細(xì)胞的膽管側(cè)、腸的腔面?zhèn)饶?，與MDR1P-GP的定位相似。BCRP也存在與乳腺的小葉和排泄管的頂側(cè)面。

藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體BCRP高表達(dá)于鼠原始造血干細(xì)胞中。分化的造血干細(xì)胞系中，幾乎不表達(dá)，但前紅細(xì)胞和自然殺傷淋巴細(xì)胞可以表達(dá)Bcrp1。在人中，BCRP表達(dá)與鼠相類似，在干細(xì)胞中有較高的表達(dá)，而在起源細(xì)胞表達(dá)降低，只有在自然殺傷細(xì)胞和成紅血球細(xì)胞表達(dá)，而在其他分化的細(xì)胞中沒有表達(dá)

BCRP

在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá),表達(dá)量高于MDR和MRP1.藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體3.BCRP/Bcrp1藥理生理作用

1）BCRP分布與P-GP有重疊性

提示BCRP/Bcrp1的作用類似P-GP

。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體2）保護機制阻止從胃腸吸收毒物吸收,促進(jìn)排泄脫鎂葉綠(甲酯-)酸

A（PHA）是葉綠素一種降解產(chǎn)物，為一種光毒性成分。PHA在體內(nèi)外排轉(zhuǎn)運是BCRP介導(dǎo)的，為ABCG2的特異性底物。一項研究顯示Bcrp1–/–

小鼠對的PHA光毒敏感性是的野生鼠100倍以上，在敏感性增加的同時，伴隨隨高的血藥濃度。與正常食物比較，喂養(yǎng)含PHA

或含20%紫花苜蓿食物后，血藥濃度分別增加17和24倍，而野生鼠喂養(yǎng)任何食物，血漿中PHA濃度都在檢測濃度以下.藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體3）血腦屏障的重要組成部分之一。與野生型鼠比較,mdr1a缺陷小鼠和野生型小鼠,長春堿腦攝取增加2倍,但哌唑嗪攝取不變不影響,絲裂霉素的攝取反而有所降低。合用GF120918使哌唑嗪和絲裂霉素轉(zhuǎn)運增加2.1和3倍,但GF120918不影響長春堿的轉(zhuǎn)運。在野生型鼠，PSC833增加長春堿的腦攝取,但不影響和絲裂霉素的攝取。合用GF120918使哌唑嗪和絲裂霉素攝取分別增加1.5和2倍,GF120918也使長春堿的攝取增加。abcg2mRNA主要在腦微血管中表達(dá)，約是皮層的700倍。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體（4）在骨髓細(xì)胞的

“傍細(xì)胞群”

（sidepopulation，SP）中作用。

從骨髓中分離到一類細(xì)胞，這類細(xì)胞用Hoechst33342染色，結(jié)合雙波長熒光顯示淺紅色和淺藍(lán)色熒光，用維拉帕米預(yù)處理，淺著色細(xì)胞消失。這類細(xì)胞稱之為傍細(xì)胞群。？？淺著色提示細(xì)胞內(nèi)Hoechst33342濃度低，研究顯示在SP細(xì)胞中表有BCRP/Bcrp1，促進(jìn)Hoechst33342外排所致.

SP中富含未分化的干細(xì)胞，而在分化的干細(xì)胞系中BCRP/Bcrp1表達(dá)低或缺乏。類似SP也出現(xiàn)在骨骼肌和胚胎等其他組織干細(xì)胞,伴隨Bcrp1的高表達(dá).BCRP/Bcrp1高表達(dá)可能是各種干細(xì)胞的一般特性.

藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體功能？？ABCG2

基因缺陷引起骨髓中和骨骼肌中SP細(xì)胞數(shù)降低，用轉(zhuǎn)染BCRP（-/-）骨髓細(xì)胞移植小鼠內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞再注入（repopulation）能力降低，造血細(xì)胞對絲裂霉素敏感性增加

,與正常小鼠比較，Mdr1a/1b和

Bcrp1缺陷小鼠研究的各種造血功能正常，在SP幾乎消失.血祖先細(xì)胞對絲列霉素的敏感性增加。用

Bcrp+/+和Bcrp-/-小鼠祖先細(xì)胞研究顯示，在正常氧功能條件下，兩種細(xì)胞的克隆數(shù)相同，但缺氧條件下，Bcrp-/-小鼠祖先細(xì)胞的克隆數(shù)下降。阻斷BCRP功能顯著降低Bcrp+/+在缺氧條件下的生存力

。藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體ABCG2mNRA在造血干細(xì)胞（SP,34+/38-.34+/KDD+細(xì)胞群）中表達(dá)高，而在定向分化的祖細(xì)胞（34+/33+,34+/10+）中表達(dá)顯著下降。在大多數(shù)成熟細(xì)胞中,表達(dá)低,但在自然殺傷細(xì)胞和成紅血球細(xì)胞表達(dá)高。ABCG2可能對造血干細(xì)胞中SP形成起重要的貢獻(xiàn)。在定向分化階段，ABCG2下調(diào)，暗示該基因可能在多能干細(xì)胞方面有獨特的生理功能.藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體P-GP,MRP1和

MRP2的協(xié)同轉(zhuǎn)運1.協(xié)同轉(zhuǎn)運許多ABC載體能同時轉(zhuǎn)運多種不同底物，可能存在協(xié)同轉(zhuǎn)運，增加轉(zhuǎn)運效率。MRP1轉(zhuǎn)運長春新堿和依托甙需要還原型GSH參與。GSH促進(jìn)MRP1依賴性的依托甙或長春新堿轉(zhuǎn)運，長春新堿和依托甙也刺激MRP1-依賴性的GSH.藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體用轉(zhuǎn)染的MRP2的Sf9細(xì)胞膜囊攝取試驗顯示不同物質(zhì)對MRP2轉(zhuǎn)運雌二醇-17-

-葡萄糖醛酸甙作用不同，4種類型：1)刺激攝取

sulfanitran,p