類器官的建立及應(yīng)用

類器官的建立及應(yīng)用類器官（Organoids）指利用成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞進行體外三維（3D）培養(yǎng)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織類似物。這些3D體外培養(yǎng)系統(tǒng)可復(fù)制出已分化組織的復(fù)雜空間形態(tài)，并能夠表現(xiàn)出細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與其周圍基質(zhì)之間的相互作用和空間位置形態(tài)。能更好地用于模擬器官組織的發(fā)生過程及生理病理狀態(tài)，因而在基礎(chǔ)研究以及臨床診療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。類器官的發(fā)展歷程：圖成一個新的功能完善的海綿。在接下來的幾十年里，脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)了相似的細(xì)胞分離再分化的差異粘附假說（DAH1981年多功能干細(xì)胞（PSCs）被首次從小鼠的胚胎中分離出來，干細(xì)胞研究自此蓬勃發(fā)展。1987年李茂林等人通過模擬生物體內(nèi)微生物環(huán)境優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)條件。研究表明，EHS上皮細(xì)胞可組織成3D導(dǎo)管和小導(dǎo)管，此人胚胎干細(xì)胞。2006年，通過對小鼠和人成纖維細(xì)胞進行重組編程，成功制備了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)，這對干細(xì)胞和類器官研究有重大意義。2008年，Sasai等人通過展示人類大腦誘導(dǎo)多能干細(xì)胞自組織到形成極化皮質(zhì)組織的神經(jīng)細(xì)胞，奠定了類腦器官的基礎(chǔ)。2009年，HansClevers和他的同事首次證明了單個Lgr5+腸道干細(xì)胞（ASCs）可以自行組織分化形成包含所有腸細(xì)胞類型的腸隱窩-絨毛結(jié)構(gòu).這開啟了類器官技術(shù)發(fā)展的新時代。在此基礎(chǔ)上類器官模型成為替代傳統(tǒng)細(xì)胞系和異質(zhì)動物模型的新型研究模型。2010年，研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎腎干細(xì)胞分離再組合可形成腎類器官。腸類器官可從體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成。類大腦類器官由小頭患者的iPSCs細(xì)胞分化形成。Lee等人發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和成年細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞在三維共培養(yǎng)模式下可產(chǎn)生肺類器官。乳腺、輸卵管和海馬類器官是在2015年研究得出的，蛇毒腺類器官產(chǎn)生于2020年。類器官模型的構(gòu)建：目前3D類器官培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成功培養(yǎng)出大量具有部分關(guān)鍵生理結(jié)構(gòu)和功能的類組織器官，常見的類器官可以分為兩大類：組織細(xì)胞來源類器官（如腫瘤類器官）和多能干細(xì)胞來源類器官（如腸類器官、腦類器系膜，剪刀沿腸道剪開，用預(yù)冷的PBS洗3-5次，用載玻片小心的將小腸表面的絨毛刮去（顯微鏡下鏡檢將刮好的小腸放入50ml離心管中，置于冰上2）將小腸轉(zhuǎn)移至生物冰箱中消化30min3）將消化好的小腸轉(zhuǎn)移至50ml；（冷的基質(zhì)膠重懸（需充分混勻）；（9）接板，24孔板接50ul的重懸液（注：基質(zhì)膠種在孔全培養(yǎng)基，然后每隔2-3天換一次培養(yǎng)基，5-7天傳代一次。圖2.小腸類器官的培養(yǎng)流程2、腫瘤類器官培養(yǎng)（以腸癌為例1）將組織放入含有特殊組織保存液的組織取樣瓶中放入冰盒4℃。（2）取樣瓶消毒，組織放入培養(yǎng)皿，結(jié)直腸癌代酶解液消化，37℃震蕩消化10-20min消化過程中隨時觀察消化情況）加入三倍體積organo原代酶終止液終止消化。（4）使用100μm孔徑的篩網(wǎng)進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察，可以看到明顯的組織塊，將濾液收集后于300g富集離心3-5min后移去上清，重新重懸離心。（5）去除上清，使用適量基質(zhì)膠進行重懸(24孔板為例，每孔30ul）之后進添加培養(yǎng)基（恢復(fù)室溫）進行培養(yǎng)。圖3.腫瘤類器官的培養(yǎng)流程類器官的應(yīng)用：與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，3D培養(yǎng)的類器官包含多種細(xì)胞類型，可以形成功能性“微型器官”，更好地模擬器官組織的發(fā)生過程和生理病理狀態(tài)。類類器官彌補了現(xiàn)有模型系統(tǒng)的某些局限性，提供了一個穩(wěn)定的系統(tǒng)，易于培養(yǎng)和操作，同時在體內(nèi)更能代表身體結(jié)構(gòu)。到目前為止，類器官培養(yǎng)物由于能夠更好地模擬體內(nèi)環(huán)境已用于多種組織，包括腸道、心臟、肝臟、胰腺、腎臟、前列腺、肺、視網(wǎng)膜和大腦。這無疑為腫瘤研究、疾病建模、藥物篩選、再生醫(yī)學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域介于動物和細(xì)胞水平之間提供了更好的解決方案。類器官以其在體外長期增殖、可傳代性、高度保持源器官結(jié)構(gòu)和功能等特性在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。目前類器官在機體生長發(fā)育、疾病病理、藥物篩選及毒理學(xué)評價、再生醫(yī)學(xué)、生物材料等研究中顯示出巨大潛力。的多樣化應(yīng)用1、疾病模型類器官為胚胎發(fā)育和成人組織的病理學(xué)建模提供了一個平臺。類器官在功能和結(jié)構(gòu)上與體內(nèi)器官相似，也可用于模擬致病過程，包括傳染性、遺傳性和退行性疾病的模型。例如，如果胃類器官感染了幽門螺桿菌，則可以探索幽門螺桿菌的感染機制。包含病理的細(xì)胞可以使用基因編輯技術(shù)生成或從患者身上提取。已經(jīng)使用CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)生成了腎臟類器官的病理模型。由人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）產(chǎn)生的皮質(zhì)類器官已被開發(fā)用于模擬Miller-Dieker綜合征。在疾病建模中，一些動物模型不能完全復(fù)現(xiàn)人類的體內(nèi)狀況，例如肺組織。由人體細(xì)胞生成的類器官除了倫理問題之外能克服動物模型原有的局限性。類器官通?？梢詮恼Ｈ松掀ぜ?xì)胞中獲得，可用于體外模擬惡性腫瘤各個階段的突變，揭示癌癥基因組的復(fù)雜性以及在腫瘤發(fā)展中基因突變的重要作用，發(fā)現(xiàn)精準(zhǔn)癌癥治療的藥物靶點。此外，用于癌癥研究的類器官，一個非常有用的發(fā)展是與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)類器官。這些方法是接近生理性腫瘤微環(huán)境(TME)的重要步驟，并為基于免疫的治療提供了平臺。腫瘤是一種復(fù)雜的疾病，無論是發(fā)病機制、轉(zhuǎn)移機制，還是患者對治療的反應(yīng)和耐藥機制，都有許多問題亟待探索。未來的研究需要不斷完善對TME的模擬，建立更接近原始腫瘤性質(zhì)的腫瘤類器官模型，從而對惡性腫瘤有更全面的認(rèn)識。2、藥物發(fā)現(xiàn)與篩選一般來說，新藥的創(chuàng)制需要經(jīng)過藥物靶點選擇、先導(dǎo)化合物鑒定、候選藥物選擇、動物安全性和有效性評價、人體臨床試驗等一系列過程。目前的藥物研發(fā)主要以分子、細(xì)胞和動物為主。它涉及藥物的毒性和有效性，因此必須經(jīng)過動物到人類的實驗過程，不能直接在人體上進行試驗。然而，動物模型離人類還很遠(yuǎn)。因此，非常需要一種接近人體的疾病模型用于藥物研發(fā)，以降低新藥研發(fā)的成本和時間。類器官的應(yīng)用可以大大提高這方面效率。類器官的出現(xiàn)對藥物發(fā)現(xiàn)具有很大的吸引力，因為它們可以用于捕捉疾病異質(zhì)性的一系列亞型并且大規(guī)模生產(chǎn)進行長期存儲，創(chuàng)建生物庫。類器官生物庫為測試藥物安全性和有效性提供了機會。毒理學(xué)研究可用于評估安全性。對于功效測試，已經(jīng)開發(fā)了幾種高通量方法，可以在一周內(nèi)獲取藥物反應(yīng)結(jié)果。類器官主要優(yōu)勢之一是在藥物開發(fā)中可以生成正常的類器官并且利用它來篩選僅針對腫瘤細(xì)胞而不傷害健康細(xì)胞的藥物。在臨床試驗中，不耐受的不良反應(yīng)是導(dǎo)致藥物失敗的主要原因，包括肝毒性、心臟毒性和腎毒性。肝臟類器官可用于測試藥物的肝毒性。藥物相關(guān)的肝毒性主要由細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)，細(xì)胞色素P450酶的作用可以在接近生理水平的肝類器官中觀察到。心臟毒性反應(yīng)，如心律失常和心臟功能下降也可以在類器官中進行測試。此外，腎臟類器官也已用于藥物毒理學(xué)研究。將類器官技術(shù)應(yīng)用于臨床前藥物毒理學(xué)研究有助于降低藥物臨床試驗的失敗率，減少藥物臨床試驗中不良事件的發(fā)生。類器官藥物試驗?zāi)Ｐ筒荒芡耆娲鷦游锬Ｐ?，但可以起到重要的補充作用。到目前為止，類器官已被用于治療結(jié)腸癌和囊性纖維化等疾病的藥物篩選。3、再生醫(yī)學(xué)與器官修復(fù)除了體外應(yīng)用外，類器官也被用于移植到其他生命體中研究以評估再生能力，成功的移植為類器官在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用鋪平了道路。與植入式醫(yī)療設(shè)備相比，自體器官移植更不易受到磁場或物理攻擊的影響，并且與同種異體器官移植相比，排斥的機會更低。類器官還可以通過用恢復(fù)的組織替換受損器官來在當(dāng)代遺傳基因異常的情況下進行基因校正。4、個性化用藥預(yù)測患者對治療的反應(yīng)是類器官技術(shù)的另一個潛在應(yīng)用。類器官提供了對個體患者疾病的獨特見解，并顯示出個性化治療的潛力。通過在體外對患者來源的類器官進行一些治療操作，可以根據(jù)類器官的反應(yīng)來預(yù)測提供活檢的患者對治療可能出現(xiàn)的反應(yīng)，從而為患者選擇最合適的治療方案。個性化醫(yī)療旨在通過在分子和藥物基因組水平上更好地描述疾病，為每位患者制定有效的治療方案。例如，測量來自囊性纖維化患者的直腸類器官中囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的功能可以確定從囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)劑矯正治療中的受益對象。對14例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者1977個類器官癌相關(guān)基因的遺傳分析顯示，90%的體細(xì)胞突變與來自同一患者活檢標(biāo)本的類器官相同，與原始腫瘤對應(yīng)的DNA拷貝數(shù)譜的相關(guān)系數(shù)為0.89。該實驗表明，類器官可以很好地捕捉到原發(fā)腫瘤的遺傳特性，這一實驗為類器官在個體化醫(yī)療中的應(yīng)用提供了有力的證據(jù)。5、癌癥免疫治療類器官與免疫細(xì)胞的體外共培養(yǎng)可以擴增免疫細(xì)胞，增強免疫應(yīng)答，為后續(xù)的免疫治療提供有力保障。此外，腫瘤微環(huán)境的研究也離不開類器官與免疫細(xì)胞等細(xì)胞的共培養(yǎng)技術(shù)。綜上所述，來源于不同人體組織的類器官可用于藥物研究、藥物篩選和新藥開發(fā)。它們還可以通過基因編輯來研究腫瘤出現(xiàn)和惡化的機制，并在體外用于預(yù)測患者對臨床治療的反應(yīng)，從而幫助患者制定個性化的醫(yī)療計劃。雖然類器官有許多潛在用途，但目前仍存在很大的局限性。迄今為止建立的所有類器官系統(tǒng)在體內(nèi)發(fā)育的可重復(fù)性方面仍需要改進。例如，視網(wǎng)膜類器官雖然很好地表現(xiàn)出典型的層狀組織，但外部部分未能形成，光感受器官不能完全成熟以變得對光敏感。類似的，大腦類器官呈現(xiàn)了大腦發(fā)育中早期的特征，但隨后的特征（如皮質(zhì)層）還沒有完全形成。并且需要開發(fā)更多的培養(yǎng)方法來提高生成效率，縮短類器官模型的培養(yǎng)周期，降低培養(yǎng)成本。發(fā)育成熟問題似乎是類器官技術(shù)中的一個常見障礙，它是否會顯著影響其治療還有待觀察。但確定的是，人類腸道類器官已被證明具有成熟腸道的特征并產(chǎn)生Lgr5+成體干細(xì)胞。一旦異位移植成功用于治療，其他類器官就可能會被誘導(dǎo)完全成熟，這些研究方向可能成為未來類器官研究的主要焦點。案例展示：案例一文章描述了一個由患者來源的膀胱癌類器官生物樣本庫，它概括了人類非肌肉浸潤性和肌肉浸潤性膀胱癌的組織病理學(xué)和分子譜特征。類器官保留了原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性，并在傳代培養(yǎng)和異種移植過程中出現(xiàn)克隆進化。通過患者在疾病復(fù)發(fā)前后獲得的活檢樣本，可以有效地建立類器官，這些來自復(fù)發(fā)性膀胱癌患者的類器官為研究原發(fā)實體腫瘤的腫瘤演化和藥物反應(yīng)提供了一個很好的模型系統(tǒng)，用以闡明復(fù)發(fā)的體細(xì)胞突變的生物學(xué)功能及其在介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和促進疾病進展方面的作用。此外類器官可與原位異種移植高效地進行轉(zhuǎn)換，發(fā)揮不同模型的特定實驗優(yōu)勢。對膀胱腫瘤器官的藥物反應(yīng)分析表明，分子突變譜與治療抗性變化相關(guān)，并且可以通過體內(nèi)異種移植來驗證藥物的特異性反應(yīng)。整個研究表明，患者來源的膀胱腫瘤類器官代表了一個準(zhǔn)確的模型系統(tǒng)，在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的背景下，患者的膀胱癌類器官是研究腫瘤演化和治療反應(yīng)的可靠模型。通過在類器官篩選鑒定出的藥物可以在類器官的異種移植中得到驗證，并且原則上可以用于指導(dǎo)膀胱內(nèi)治療。文章作者指出，下一步必須進行“聯(lián)合”（腫瘤類器官與患者）臨床試驗，以確定患者來源的膀胱腫瘤類器官對藥物治療的反應(yīng)是否能概括患者對體內(nèi)相同治療的反應(yīng)，證實類器官在預(yù)測腫瘤臨床藥敏方面的作用。案例二本文作者采用了一種在毫米流控芯片上（流式培養(yǎng)）體外培養(yǎng)腎器官的方法，該方法擴大了內(nèi)皮祖細(xì)胞的內(nèi)源性集群，并通過管壁細(xì)胞所包圍的可灌注腔生成血管網(wǎng)絡(luò)。為了評估不同培養(yǎng)方式得到的類器官在某一方面的性狀和生理功能，常常需要對類器官的各種發(fā)育與細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物進行鑒定。在文章中，研究人員發(fā)現(xiàn)具有粘附作用的胞外基質(zhì)（ECM）比不具有粘附作用的ECM為類器官中的血管發(fā)生提供了更好的培養(yǎng)條件，從血管發(fā)生相關(guān)標(biāo)志物MCAM、PECAM1以及PODXL的染色情況可以明顯觀察到兩者的效應(yīng)差異。為了評估流式培養(yǎng)腎臟類器官的血管形成情況，研究人員繼續(xù)觀察了在高流體剪切力（FSS）下體外培隨著時間的推移形成了新的腎單位，提示FSS是促進體外培養(yǎng)腎臟類器官的血管生成的環(huán)案例三肺上皮來源于內(nèi)胚層胚芽層，經(jīng)過一系列復(fù)雜的內(nèi)胚層-中胚層介導(dǎo)的信號事件，最終形成由支氣管、細(xì)支氣管和氣體交換單位組成的樹枝狀網(wǎng)絡(luò)。這些階段包括內(nèi)胚層誘導(dǎo)、前后和背腹圖案化、肺規(guī)格化、肺出芽、分枝形態(tài)發(fā)生，以及最后成熟。這篇文章中，作者詳細(xì)概括了這幾個發(fā)展階段，以便分化人類多能干細(xì)胞(hpscs)為腹前前腸球狀體和進一步分化為兩種不同類型的器官:人類肺臟器官和芽尖祖細(xì)胞器。由此產(chǎn)生的人類肺臟器官具有類似于發(fā)育中的人類氣道的支氣管/細(xì)支氣管的細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu)，它們被肺間質(zhì)包圍，細(xì)胞表達肺泡細(xì)胞標(biāo)志物。芽尖前體細(xì)胞具有高度增殖的多能細(xì)胞群，具有體外多向分化潛能和體內(nèi)植入衍生的模型已經(jīng)用人胎兒組織進行了基準(zhǔn)測試，發(fā)現(xiàn)它們是人類胎兒樣組織的代