《動物微生物與免疫》課件-3.細(xì)菌的培養(yǎng)技術(shù)

3.細(xì)菌的培養(yǎng)技術(shù)一、細(xì)菌的化學(xué)組成細(xì)菌的化學(xué)組成水分（75~85%）固形物（15~25%）有機(jī)物其他有機(jī)物無機(jī)物蛋白質(zhì)核酸糖類脂類二、細(xì)菌的營養(yǎng)需要

營養(yǎng)要素：水、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子1.碳源用于合成菌體的含碳物質(zhì)，如多糖、脂類、蛋白質(zhì)、核酸等利用碳源類型不同｛有機(jī)碳：糖類（單糖、雙糖）無機(jī)碳：CO2、碳酸鹽異養(yǎng)微生物自養(yǎng)微生物用來合成菌體蛋白質(zhì)、核酸及其他含氮物質(zhì)2.氮源氮源｛有機(jī)氮無機(jī)氮銨鹽硝酸鹽N2｛｛蛋白質(zhì)核酸氨基酸尿素大多數(shù)病原菌3.生長因子那些微生物生長所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成的或合成量不足以滿足機(jī)體生長需要的有機(jī)化合物微生物生長因子需要量（ml-1

III型肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）膽堿 6ug 金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus） 硫胺素 0.5ng 白喉棒桿菌（Cornebacteriumdiphtherriae）B-丙氨酸1.5ug 破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌（Clostridiumtetani）尿嘧啶0-4ug 腸膜狀串珠菌（Leuconostocmesenteroides)吡哆醛 0.025ug4.無機(jī)鹽常量元素：鈉、鉀、硫、磷等微量元素：鐵、銅、鋅、鎂等調(diào)節(jié)滲透壓，構(gòu)成菌體成分，參與酶的活性，是細(xì)菌生長所必需的三、細(xì)菌的新陳代謝定義：在酶控制和催化下，分解代謝+合成代謝類型：不同細(xì)菌具有不同的酶，對糖、蛋白質(zhì)等的分解能力以及分解后的代謝產(chǎn)物也不相同，可作為鑒定細(xì)菌的重要手段，通過觀察細(xì)菌的代謝產(chǎn)物來鑒定細(xì)菌的試驗稱為細(xì)菌生化反應(yīng)。(一)細(xì)菌的分解代謝產(chǎn)物及意義糖發(fā)酵試驗細(xì)菌對糖的發(fā)酵情況：①不分解糖：②分解糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣：③分解糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：培養(yǎng)基顏色與接種前相比無變化，記錄時用“-”表示。培養(yǎng)基中的指示劑（溴甲酚紫）由紫色變?yōu)辄S色，記錄時以“＋”表示。除培養(yǎng)基中的指示劑外，液體培養(yǎng)基的小導(dǎo)管中還有氣泡，記錄時以“⊕”表示。（二）細(xì)菌的合成代謝產(chǎn)物A、與致病有關(guān)的代謝產(chǎn)物B、與治療有關(guān)的代謝產(chǎn)物C、與鑒別細(xì)菌有關(guān)的代謝產(chǎn)物可分為：（二）細(xì)菌的合成代謝產(chǎn)物A、與致病有關(guān)的代謝產(chǎn)物1.毒素：包括內(nèi)毒素和外毒素。2.熱原質(zhì)：細(xì)菌合成的多糖，極微量注入人或動物體內(nèi)即可引起發(fā)熱反應(yīng)。3.侵襲性酶類：某些病原菌在代謝過程中產(chǎn)生的具有損傷機(jī)體組織、促使細(xì)菌侵襲和擴(kuò)散的致病性物質(zhì)。如金葡產(chǎn)生的血漿凝固酶。B、與治療有關(guān)的代謝產(chǎn)物1.抗生素大多由放線菌和真菌產(chǎn)生，細(xì)菌產(chǎn)生的很少。2.維生素某些細(xì)菌能合成自身所需的維生素，并能分泌到菌體外供人體吸收利用。（大腸埃希菌）（三）細(xì)菌的代謝產(chǎn)物（合成代謝）

C、與鑒別細(xì)菌有關(guān)的代謝產(chǎn)物1.色素（pigments）

水溶性色素：能彌散到培養(yǎng)基或周圍組織脂溶性色素：不溶于水，只存在于菌體，使菌落顯色而培養(yǎng)基顏色不變。2.細(xì)菌素（bacteriocins）某些細(xì)菌產(chǎn)生的僅對近緣菌株有抗菌作用的蛋白質(zhì)。（三）細(xì)菌的代謝產(chǎn)物（合成代謝）四、細(xì)菌的生長繁殖（一）細(xì)菌生長繁殖的條件（二）細(xì)菌的繁殖方式與強(qiáng)度（三）細(xì)菌的生長曲線（一）細(xì)菌生長繁殖的條件1.營養(yǎng)物質(zhì)2.溫度3.pH4.氣體大多數(shù)細(xì)菌的最適pH為中性或弱堿性（7.2～7.6），許多細(xì)菌在代謝過程中分解糖，產(chǎn)生酸，使pH下降，抑制細(xì)菌生長。大多數(shù)病原菌的最適溫度為37℃。與細(xì)菌生長繁殖有關(guān)的氣體主要是氧氣和二氧化碳，此外，有些固氮菌能夠固定空氣中的氮?dú)?。（一）?xì)菌生長繁殖的條件根據(jù)細(xì)菌對氧的需要情況分為：專性需氧菌（aerobe）:必須在有氧的環(huán)境中才能生長繁殖。如結(jié)核分枝桿菌專性厭氧菌（anaerobe）:缺乏呼吸酶，只有在無氧狀態(tài)下才能生長。如破傷風(fēng)芽胞梭菌兼性厭氧菌（facultativeanaerobe）:在有氧或無氧狀態(tài)下均能生長，但在有氧時生長較好。大多數(shù)病原菌屬于此類。微需氧菌:在低氧狀態(tài)下生長最好。（二）細(xì)菌生長繁殖的方式與速度

細(xì)菌主要以二分裂方式進(jìn)行無性繁殖，一個細(xì)菌分為兩個菌體所需的時間稱為世代時間，簡稱世代。在適宜的人工條件下，多數(shù)細(xì)菌的世代為20～30min。如果按20min繁殖一代計算，10h后，一個細(xì)菌可以繁殖10億個以上的細(xì)菌。（三）細(xì)菌群體生長及生長曲線以細(xì)胞增長數(shù)目的對數(shù)做縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間做橫坐標(biāo)，可繪制一條細(xì)菌的生長曲線?？煞譃樗膫€時期：延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。時間細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)1.延遲期

又稱停滯期，是微生物細(xì)胞進(jìn)入一個新環(huán)境的適應(yīng)時期。此時的微生物數(shù)量不增加，細(xì)胞的形態(tài)變大或者變長。處在延遲期的細(xì)胞代謝能力強(qiáng)，積累了足夠的酶、輔酶和中間代謝產(chǎn)物，為細(xì)胞分裂增殖做準(zhǔn)備。一般1~4h。2.對數(shù)期

又稱指數(shù)期，是細(xì)菌細(xì)胞適應(yīng)了新的環(huán)境后生長最為旺盛的一個時期，在此時期細(xì)胞的數(shù)目以幾何級數(shù)增長，故稱對數(shù)期。對數(shù)期細(xì)菌有以下特點(diǎn)：

1）形態(tài)、染色、生物活性都很典型

2）對外界環(huán)境因素作用敏感因此，此時期是研究菌體的最佳時期。3.穩(wěn)定期

又稱恒定期或最高生長期。由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗、毒性物質(zhì)積累、pH下降等不利因素影響，細(xì)菌繁殖速度逐漸下降，死亡數(shù)逐漸增加，此時新繁殖的細(xì)胞數(shù)目與死亡的細(xì)胞數(shù)目相等。多數(shù)的芽孢菌在這時產(chǎn)生芽孢，有些微生物在穩(wěn)定期時還開始合成抗生素等次生代謝產(chǎn)物。4.衰亡期

在衰亡期中，個體的死亡速度超過個體的新生速度，因此，整個群體就呈現(xiàn)負(fù)增長，活細(xì)胞的數(shù)目明顯下降。

這時，細(xì)菌變腫脹或畸形衰變，甚至菌體自溶，難以辨認(rèn)其形，因此陳舊培養(yǎng)物上難以鑒別細(xì)菌。討論：如何利用細(xì)菌的生長規(guī)律指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)？時間細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)微生物生長規(guī)律對工業(yè)生產(chǎn)的指導(dǎo)：（1）縮短延遲期

延遲期的存在則使發(fā)酵周期延長，為提高設(shè)備的使用率及降低生產(chǎn)成本則需縮短延遲期。（2）把握對數(shù)期

連續(xù)投放或補(bǔ)加發(fā)酵原料，會使菌體隨營養(yǎng)濃度增加而生長速率上升，從而可獲得大量的菌體。微生物生長規(guī)律對工業(yè)生產(chǎn)的指導(dǎo)：（3）延長穩(wěn)定期

對于合成產(chǎn)物與微生物細(xì)胞的形成過程同步的，穩(wěn)定期的末期為最佳收獲期，因此，延長穩(wěn)定期可以獲得更多的產(chǎn)品。（4）監(jiān)控衰亡期

微生物在衰亡期，細(xì)胞活力明顯下降，同時由于逐漸積累的代謝毒物可能會與代謝產(chǎn)物起某種反應(yīng)或影響提純，或使其分解。因而必須掌握時間，在適當(dāng)?shù)臅r候結(jié)束發(fā)酵。小結(jié)細(xì)菌的營養(yǎng)需要細(xì)菌的代謝產(chǎn)物細(xì)菌的生長和繁殖：條件和生長階段五、細(xì)菌的人工培養(yǎng)想一想：為什么要對細(xì)菌進(jìn)行人工培養(yǎng)？1.用于細(xì)菌感染癥的診斷和治療分離培養(yǎng)病原菌藥物敏感試驗2.生物制品的制備：如滅活疫苗，喪失感染性或毒性，而保持免疫原性的細(xì)菌3.基因工程（一）培養(yǎng)基的概念和種類培養(yǎng)基是人工配制的含有細(xì)菌生長繁殖所需營養(yǎng)的基質(zhì)。需具備的條件：①根據(jù)實驗?zāi)康囊羞m宜的營養(yǎng)物質(zhì)②具有適當(dāng)?shù)乃釅A度③培養(yǎng)基本身必須無菌用什么來培養(yǎng)細(xì)菌？按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.0%-2.0%瓊脂含量一般為0.2%-0.7%不加任何凝固劑半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基常用來進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏觀察微生物的運(yùn)動特征大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實驗室進(jìn)行微生物的擴(kuò)增（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長情況1）在液體培養(yǎng)基上的生長情況菌膜生長沉淀生長混濁生長對照2）細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長情況（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長情況菌落：單個細(xì)菌在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖出數(shù)量巨大的菌體，形成一個肉眼可見的、有一定形態(tài)的群體。眾多菌落連成一片，形成菌苔。菌苔菌落3）在固體培養(yǎng)基上的生長情況（二）細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長情況從菌落概念可知：1.是在固體培養(yǎng)基上，如果是液體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基上，將很難看到菌落。2.由1個細(xì)菌繁殖而來。3.一個菌落里只有一種細(xì)菌。下面大家看一組圖片，這組圖片是不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)基上形成的菌落，大家可以看出不同細(xì)菌在相同培養(yǎng)基上形成菌落特征是不一樣的，因此學(xué)習(xí)細(xì)菌的菌落具有什么意義呢?大腸桿菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成黑色帶金屬光澤的菌落大腸桿菌在SS培養(yǎng)基上形成紅色帶金屬光澤的菌落同一細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上形成不同特征的菌落。不同細(xì)菌在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征（形狀、大小、顏色、氣味等），是鑒定細(xì)菌的重要依據(jù)之一。我們可根據(jù)細(xì)菌形成的菌落特性進(jìn)行初步鑒定。學(xué)習(xí)菌落的意義：細(xì)菌菌落形態(tài)的多樣性不同大小、顏色的菌落不同表面性狀的菌落表面光滑表面粗糙溶血現(xiàn)象的菌落根據(jù)溶血的程度不同可形成草綠色（1~2mm）、寬大透明（2~4mm）的溶血環(huán)我們可以從哪些方面觀察和描述菌落呢？(1)大小：用毫米(mm)表示。露滴狀菌落（＜1mm），小菌落（1~2mm），中等大菌落（2~4mm），大菌落（4~6mm），巨大菌落（＞6mm）。(2)顏色及透明度：無色、灰白色，有的能產(chǎn)生各種色素；菌落是否有光澤；其透明度可分為透明、半透明及不透明。(3)形狀：圓形、不規(guī)則形、根足形、葡萄葉形。(4)隆起度：表面有隆起、輕度隆起、中央隆起，也有陷凹者。(5)邊緣：整齊、鋸齒狀、波狀等。(6)表面性狀：平滑、粗糙、皺褶、龜裂、同心環(huán)狀等。(7)質(zhì)地：黏液狀、膜狀、干燥或濕潤等。(8)溶血情況：若是鮮血瓊脂平皿，應(yīng)看其是否溶血及溶血情況。金黃色葡萄球菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成金黃色、中等大小、圓形、隆起、濕潤、邊緣整齊、表明光滑、有光澤、不透明的菌落選擇+鑒別培養(yǎng)基：用于糞便、分泌物中腸道致病菌及腸球菌的分離培養(yǎng)。主要成分：蛋白胨、脙胨豬膽鹽