《獸藥產(chǎn)品中 8 種藥物含量的同時(shí)測(cè)定 高效液相色譜-二極管陣列法》

ICS

CCS

GDNB

廣東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GDNBXXXX—2023

獸藥產(chǎn)品中8種藥物含量的同時(shí)測(cè)定

高效液相色譜-二極管陣列法

SimultaneousDeterminationofEightDrugsinVeterinaryPreparationsby

HighPerformanceLiquidChromatographyMethod

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

廣東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)?發(fā)布

T/GDNBXXXX—2023

獸藥產(chǎn)品中8種藥物含量的同時(shí)測(cè)定

高效液相色譜-二極管陣列法

1范圍

本文件規(guī)定了用高效液相色譜二極管陣列法同時(shí)測(cè)定獸藥產(chǎn)品中8種獸藥含量的檢測(cè)方法。

本文件適用于水劑、可溶性粉和預(yù)混劑等獸藥制劑中磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、甲

氧芐啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、泰樂菌素、替米考星的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4檢測(cè)原理

采用高效液相色譜，在選定的色譜條件下，通過C18色譜柱分離獸藥制劑中主成分，用二極管陣列

檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定8種獸藥，外標(biāo)法定量。

5試劑和材料

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。

試劑

5.1.1水：符合GB/T6682-2008規(guī)定的一級(jí)水指標(biāo)。

5.1.2甲醇(CH3OH)：色譜純；CAS號(hào)：67-56-1。

5.1.3乙腈(CH3CN)：色譜純；CAS號(hào)：75-05-8。

5.1.4磷酸(H3PO4)：CAS號(hào)：7664-38-2。

5.1.5磷酸二氫鉀(K2HPO4)：CAS號(hào)：7778-77-0。

5.1.6三乙胺(C6H15N)：CAS號(hào)：121-44-8。

溶液配制

5.2.110mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH3.0）配制：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀約1.36g，加入4mL磷酸，用

超純水溶解定容至1L，并用三乙胺溶液調(diào)pH至3.0，過0.45μm濾膜。

對(duì)照品

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5.3.1甲氧芐啶對(duì)照品：CAS號(hào)：738-70-5，純度≥92.6%，見附錄A。

5.3.2磺胺嘧啶對(duì)照品：CAS號(hào)：68-35-9，純度≥84.7%，見附錄A。

5.3.3磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品：CAS號(hào)：1220-83-3，純度≥98.0%，見附錄A。

5.3.4磺胺甲噁唑?qū)φ掌罚篊AS號(hào)：723-46-6，純度≥95.0%，見附錄A。

5.3.5環(huán)丙沙星對(duì)照品：CAS號(hào)：85721-33-1，純度≥99.5%，見附錄A。

5.3.6恩諾沙星對(duì)照品：CAS號(hào)：93106-60-6，純度≥98.5%，見附錄A。

5.3.7替米考星對(duì)照品：CAS號(hào)：108050-54-0，純度≥98.5%，見附錄A。

5.3.8泰樂菌素對(duì)照品：CAS號(hào)：1405-53-4，純度≥99.0%，見附錄A。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制

5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：分別稱取上述8種藥物對(duì)照品50mg，精密稱定，分別置于10mL容量

瓶中，使用甲醇溶解，定容、搖勻，配制成濃度均為5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，儲(chǔ)存在-20℃，保存3

個(gè)月。

5.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別準(zhǔn)確量取1mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于10mL的容量瓶中，使用

甲醇溶解并定容，配制成濃度為500μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下冷藏保存。使用前以流動(dòng)相稀釋配

制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

材料

5.5.1濾膜：0.45μm有機(jī)濾膜。

6儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀：配二極管陣列檢測(cè)器。

色譜柱：HPLCONEC18柱，柱長250mm，柱內(nèi)徑4.6mm，3μm粒徑，或等同性能者。

分析天平：感量0.1mg。

容量瓶：1000mL、100mL、10mL。

微量移液器：20-200μL、100-1000μL量程。。

7測(cè)定步驟

試樣提取

7.1.1粉劑和預(yù)混劑

稱取含上述8種獸藥成分的供試品適量（按照標(biāo)示含量折算約含主成分100mg），于100mL容量

瓶中，使用甲醇溶解并定容，混勻、過濾，配制成濃度約為1mg/mL的供試品溶液。再用初始流動(dòng)相

稀釋，制備濃度約為100μg/mL的混合供試品溶液。

7.1.2注射液

分別移取含上述8種獸藥成分供試品溶液適量體積，于10mL容量瓶中，使用甲醇溶解并定容，逐

層稀釋，制備成濃度約1mg/mL的供試品溶液。再用初始流動(dòng)相稀釋，配制濃度約為100μg/mL的混合

供試品溶液。

儀器參考條件

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7.2.1色譜柱：HPLCONEC18柱，柱長250mm，柱內(nèi)徑4.6mm，3μm粒徑，或等同性能者。

7.2.2流動(dòng)相：A為10mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH3.0），B為乙腈。

7.2.3洗脫程序：梯度洗脫，如表1。

7.2.4流速：1mL/min。

7.2.5掃描波長：200nm～300nm。甲氧芐啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶及磺胺甲氧嗪檢測(cè)波長選

擇270nm；環(huán)丙沙星、恩諾沙星、替米考星及泰樂菌素選擇280nm。

7.2.6進(jìn)樣量：10μL。

表1梯度洗脫程序表

時(shí)間（min）A相（%）B相（%）變化曲線

090106

180206

680206

860406

1260406

1440606

1640606

1890106

2090106

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)定

將25、50、75、100、150、200μg/mL系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按上述色譜條件進(jìn)樣分析。分別

以藥物的濃度為橫坐標(biāo)x，藥物的峰面積為縱坐標(biāo)y作圖，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)（r），

如果r大于0.999表明該方法在藥物濃度在所選濃度范圍內(nèi)線性良好。

試樣測(cè)定

將供試品溶液（見7.1）按色譜條件（見7.2）進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，根據(jù)色

譜峰面積從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上計(jì)算出相應(yīng)的磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、甲氧芐啶、恩諾沙

星、環(huán)丙沙星、泰樂菌素、替米考星等8種獸藥的濃度。供試品溶液中8種獸藥的響應(yīng)值應(yīng)在儀器測(cè)定

的線性范圍內(nèi)，否則應(yīng)重新調(diào)整濃度后測(cè)定。本方法8種獸藥對(duì)照品的典型高效液相色譜圖見附錄B。

8結(jié)果計(jì)算和表述

試樣中主成分含量X，按下式計(jì)算：

C×V×f

X=………………（1）

m×1000

式中：

3

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X—試樣中主成分的含量，g/g；

C—試樣溶液中對(duì)應(yīng)藥物的主成分濃度，μg/mL；

V—提取溶劑的體積，mL；

m—供試試料的質(zhì)量，mg；

f—稀釋倍數(shù)。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算數(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

9檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度

在25μg/mL～200μg/mL添加濃度范圍內(nèi)，磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、甲氧芐啶、

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、泰樂菌素、替米考星等8種獸藥的平均回收率在80.0%～110.0%之間。

精密度

本方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%。

A

A

4

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附錄A

（資料性）

8種獸藥的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)結(jié)構(gòu)式

8種獸藥的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)結(jié)構(gòu)式，見表A。

表A8種獸藥的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)結(jié)構(gòu)式

中文名

CAS號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量化學(xué)結(jié)構(gòu)式

（英文名）

甲氧芐啶

738-70-5CHNO290.32

（Trimethoprim）141843

磺胺嘧啶

68-35-9CHNOS250.28

（Sulfadiazine）101042

磺胺間甲氧嘧啶

1220-83-3CHNOS280.3

（Sulfamonomethoxine）111243

磺胺甲噁唑

723-46-6CHNOS253.27

（Sulfamethoxazole）101133

環(huán)丙沙星

85721-33-1CHFNO331.341

（Ciprofloxacin）171833

恩諾沙星

93106-60-6CHFNO359.395