腫瘤基因治療的新進(jìn)展

腫瘤基因治療的新進(jìn)展廣州市第一人民醫(yī)院泌尿外科鐘惟德

隨著人類(lèi)對(duì)自身認(rèn)識(shí)的不斷深化,從人體解剖學(xué)開(kāi)始,已經(jīng)進(jìn)入了細(xì)胞和分子病理生理學(xué)研究

,特別是從基因水平上闡明人類(lèi)遺傳與疾病這一核心本質(zhì)。

－－－－－中國(guó)科學(xué)院院士

吳祖澤

當(dāng)前人類(lèi)基因組研究已經(jīng)從結(jié)構(gòu)遺傳學(xué)進(jìn)入了功能遺傳學(xué)研究,它將對(duì)疾病的診斷,預(yù)防與治

療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。腫瘤基因治療的實(shí)施主要包括以下三個(gè)方面：①尋找具有治療意義的目的基因；②建立有效的向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移目的基因的載體系統(tǒng)；③使目的基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，達(dá)到治療目的?；蛑委煹脑砗头椒?/p>

有效的基因治療依賴(lài)于外源基因高效而穩(wěn)定的表達(dá)。利用病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性而成為腫瘤基因治療中應(yīng)用最廣泛的方法，其中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒（AV）、腺相關(guān)病毒（AAV）、單純皰疹病毒（HSV）、痘苗病毒（VV）等載體。

目前常用的基因治療方法，可以歸納為以下兩種體外法（exvivo）體內(nèi)法（invivo）一種方法是體細(xì)胞基因治療或稱(chēng)“二步基因治療”，即將受體細(xì)胞在體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)移入外源基因，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)倪x擇系統(tǒng)，把重組的受體細(xì)胞回輸患者體內(nèi)，讓外源基因表達(dá)以改善患者癥狀。這種方法是目前基因治療普遍采用的方法，又稱(chēng)為體外法（exvivo）。

另一種方法稱(chēng)為“直接法基因治療”，提指不需要細(xì)胞移植而直接將外源DNA注射至機(jī)體內(nèi)，DNA可以單純注射，也可以與輔助物如脂質(zhì)體一起注射，使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)而發(fā)揮治療作用，故又稱(chēng)為體內(nèi)法（invivo）。

體內(nèi)法的基因治療方式比體外法簡(jiǎn)單、直接、經(jīng)濟(jì)，療效也比較確切，常有的體內(nèi)基因直接轉(zhuǎn)移手段有病毒介導(dǎo)、寡核苷酸直接注射、受體介導(dǎo)、脂質(zhì)體介導(dǎo)和體內(nèi)基因直接注射等。此外尚有原位法（insitu）。

TARGETINGANDROGENRECEPTORINHORMONE-INDEPENDENTCANCER:GROWTHINHIBITIONANDINDUCTIONOFAPOPTOSISTHROUGHDOWNREGULATIONOFTHEANDROGENRECEPTORWITHSMALLINTERFERENCERNA.PetraHaag,IrisEEder,Innsbruck,Austria干擾RNA對(duì)非雄激素腫瘤靶細(xì)胞生長(zhǎng)抑制與誘導(dǎo)細(xì)胞刁亡的規(guī)律基因治療策略體外法基因治療需要從患者體內(nèi)取出細(xì)胞，并以治療基因修飾，回輸表達(dá)治療基因的修飾細(xì)胞于患者；體內(nèi)法基因治療是直接注射含治療基因的載體于患者基因治療應(yīng)有兩個(gè)基本目的：一是恢復(fù)異常表達(dá)或缺失的體細(xì)胞基因的功能；另一個(gè)是引入有治療價(jià)值的其他來(lái)源的基因。

第一個(gè)目的包含的內(nèi)容較廣泛，如恢復(fù)腫瘤局部的抗腫瘤免疫功能，阻止異常表達(dá)的癌基因，恢復(fù)腫瘤抑制基因功能，恢復(fù)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因和恢復(fù)機(jī)體對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制等。第二個(gè)目的包括引入前藥轉(zhuǎn)換基因，卻除或轉(zhuǎn)移多藥耐藥基因等。

因此，腫瘤的基因治療除了干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，糾正其惡性表型外，尚恢復(fù)和加強(qiáng)腫瘤局部微環(huán)境和全身瀕瘓的抗腫瘤系統(tǒng)的功能。針對(duì)以上目的，基因治療目前主要集中在免疫基因治療、腫瘤抑制基因治療和藥物敏感基因治療等方面。研究中的主要基因治療途徑

包括1.轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼前藥活化酶基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞（HSV-TK）2.將野生型p53基因引入腫瘤細(xì)胞，使正常造血干細(xì)胞表達(dá)藥物抵抗蛋白（MDR）3.轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子基因進(jìn)入宿主細(xì)胞（IL-X）4.制備表達(dá)免疫制激分子（GM-CSF）的腫瘤細(xì)胞疫苗免疫基因治療

將抗癌免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫。

基因修飾腫瘤細(xì)胞“疫苗”療法

將某些細(xì)胞因子基因如IL-2、IL-4、TNF-α、INF-γ、GM-CSF等轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，可使腫瘤細(xì)胞表達(dá)活性細(xì)胞因子。轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子基因的腫瘤細(xì)胞基體內(nèi)致瘤性喪失，耐動(dòng)物預(yù)接腫這種轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞后，該動(dòng)物對(duì)再接種的同種腫瘤有抵抗作用。

能分泌細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞具有腫瘤疫苗作用，成為新型的腫瘤“疫苗”。這種腫瘤疫苗的作用機(jī)制是由于細(xì)胞因子表達(dá)后，一方面促進(jìn)腫瘤表達(dá)特異抗原并誘發(fā)宿

主抗腫瘤細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)；另一方面分泌的細(xì)胞因子增強(qiáng)CTL和其他抗癌效應(yīng)細(xì)胞的作用。

美國(guó)達(dá)納—法貝爾癌癥研究所的科學(xué)家通過(guò)基因工程的方法，使膀胱癌細(xì)胞

表達(dá)一種叫做GM－CSF（顆粒細(xì)胞集落刺激因子）的細(xì)胞因子，研究人員將癌細(xì)

胞處理后再將其注射給膀胱癌病人。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，70％病人的腫瘤里出現(xiàn)了浸潤(rùn)的

免疫細(xì)胞，說(shuō)明免疫系統(tǒng)已經(jīng)對(duì)腫瘤發(fā)起了攻擊。基因修飾TIL的過(guò)繼免疫療法

將細(xì)胞因子導(dǎo)入TIL細(xì)胞中，活化后的TIL具有顯著抗自身腫瘤的作用，回輸體內(nèi)后有聚集于腫瘤部位的傾向，攜帶的抗癌免疫增強(qiáng)性細(xì)胞因子基因在腫瘤局部表達(dá)量增加，同時(shí)還避免全身大劑量投用IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子所引起的嚴(yán)重毒副反應(yīng)。目前已將TNF-α基因?qū)隩IL，并在癌癥患者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)。免疫增強(qiáng)基因療法

是將MHC1類(lèi)抗原基因經(jīng)體內(nèi)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，增加其免疫原性，有效地激活機(jī)體抗癌免疫反應(yīng)，降低腫瘤細(xì)胞的致瘤性。

原位修飾腫瘤免疫原性的基因療法

直接在體內(nèi)原位修飾腫瘤免疫原性，誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒反應(yīng)，同時(shí)腫瘤組織的CTL可產(chǎn)生一種“旁觀者效應(yīng)”（bystandereffect）,即CTL不僅可以殺傷轉(zhuǎn)導(dǎo)基因陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，還可以殺傷轉(zhuǎn)導(dǎo)基因陰性腫瘤細(xì)胞，使受基因治療的瘤灶消退時(shí)，其他未治療的瘤灶也會(huì)消退。

免疫基基治療是很有前途的一種治療途徑。因?yàn)樗梢杂皿w外方式，從而避免目前缺乏體內(nèi)有效導(dǎo)入系統(tǒng)的局限性；同時(shí)，由于它可調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，因此具有“旁觀者效應(yīng)”。建立瘤苗庫(kù)和利用原遞呈細(xì)胞系統(tǒng)等也是有希望的治療途徑。癌基因拮抗療法

腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)，可以通地阻斷癌基因的表達(dá)或恢復(fù)抑癌基因的功能來(lái)抑制腫瘤的發(fā)展或恢復(fù)其正常表型。

阻斷癌基因的功能

將反義癌基因?qū)氚┘?xì)胞中、癌基因缺失突變、引入非等位基因rev等方法阻斷癌基因功能。

反義癌基因?qū)嶋H上是人工合成的與與癌基因mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸，即反義寡核苷酸（ODNs）。反義核酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些異常的基因的表達(dá)，以阻斷癌細(xì)胞內(nèi)的異常信號(hào)傳導(dǎo)，使癌細(xì)胞進(jìn)入正常分化軌道或引起細(xì)胞凋亡。

Roth等直接在瘤體內(nèi)注射攜公平野生型p53基因的重組腺病毒（Adp53）治療膀胱鱗癌和非小細(xì)胞肺癌，結(jié)果絕大多數(shù)腫瘤組織可表達(dá)p53基因，腫瘤體積縮小，瘤體壞死和調(diào)亡等。由英國(guó)、法國(guó)和意大利組織的國(guó)際臨床合作小組直接將野生型p53基因表達(dá)質(zhì)粒注射放腎癌瘤體內(nèi)，未見(jiàn)明顯毒副反應(yīng)，8例患者中有1例完全緩解達(dá)19個(gè)月，3例腫瘤體明顯縮小，此外還有報(bào)道稱(chēng)，將細(xì)胞周期抑制基因p21wafl導(dǎo)入p53缺失的腫瘤，效果比轉(zhuǎn)導(dǎo)野生型p53更好。自殺基因療法一些來(lái)自病毒或細(xì)菌的基因具有某些特殊的功有，其表達(dá)產(chǎn)物可將原先對(duì)哺乳動(dòng)物經(jīng)細(xì)胞增毒或極低毒性的藥物轉(zhuǎn)換成毒性產(chǎn)物，導(dǎo)致這些細(xì)胞死亡。將這類(lèi)基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，使之對(duì)某些藥物具有特別的功能，可以利用這些藥物使靶細(xì)胞“自殺”。

常見(jiàn)的“自殺基因”包括胸苷激酶基因（tk基因）和胞嘧啶脫氨酶基因（CD基因）等。將這些基因?qū)肽骋患?xì)胞，通過(guò)基因重組織這些基本獲得內(nèi)源性表達(dá)，生長(zhǎng)特定的酶類(lèi)，這些酶可以使無(wú)素毒或低毒性前藥轉(zhuǎn)換成毒性產(chǎn)物，阻斷核代謝途徑，使表達(dá)這些基因的細(xì)胞對(duì)某此傳真物具有特別的敏感性，最終導(dǎo)致這些細(xì)胞死亡。

極有意義的是，此類(lèi)基因更可以通過(guò)“旁觀者效應(yīng)”殺傷未導(dǎo)入基因的鄰近分裂細(xì)胞，擴(kuò)大其殺傷效應(yīng)。如將單線純疹病毒胞苷激酶基本（HSV-TK）導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，從而干擾腫瘤細(xì)胞DNA合成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，正常細(xì)胞則不被傷害。

基因修飾配合大劑量化療

癌癥患者的癌細(xì)胞中存在著能耐受多種化療藥物的高活性多藥耐藥基因（MDR1），這些患者往往抵抗多種化療藥的治療。用反義RNA或DNA滅活MDR1是提高該類(lèi)患者化療效果的有效途徑。

抗腫瘤血管形成基因治療：考慮到血管形成在腫瘤發(fā)生中的重要作用，抗血管形成的治療成為非常有潛力的控制腫瘤生長(zhǎng)的治療方法。抗血管生成基因治療的研究主要包括：（1）針對(duì)血管形成生長(zhǎng)因子及其受體的基因治療；（2）血管形成抑制因子基因治療；（3）針對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的自殺基因治療等。這些方法通過(guò)特異作用于瘤床的微血管內(nèi)皮細(xì)胞而控制腫瘤生長(zhǎng)，雖然目前抗血管形成基因治療尚未進(jìn)入臨床，但可以相信其會(huì)有較廣泛的臨床應(yīng)用前景?；蛑委煷嬖诘年P(guān)鍵問(wèn)題

基因?qū)氲妮d體系統(tǒng)問(wèn)題

目前所采用的載體主要分為兩大類(lèi)，即轉(zhuǎn)染性和轉(zhuǎn)導(dǎo)性載體。轉(zhuǎn)染性載體是利用化學(xué)或物理方法增加細(xì)胞膜的通透性而將DNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，這種方法包括脂質(zhì)體和基因槍等。轉(zhuǎn)導(dǎo)性載體則是利用病毒對(duì)細(xì)胞的天然親和力把遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的方法相對(duì)簡(jiǎn)易行，抗原性弱但效率較低，而且基因表達(dá)的持久性不夠。因此它在腫瘤基因治療中的使用受到限制，也難以取得理想效果。轉(zhuǎn)導(dǎo)法則高效、持久，但抗原性較強(qiáng)，目前大多數(shù)基因治療程序仍以病毒介導(dǎo)。

3）利用特異分子橋，這種分子橋既可與病毒顆粒相結(jié)合，也可與特異性的細(xì)胞表面受體結(jié)合的，指導(dǎo)病毒粒相結(jié)合，也可與特異性的細(xì)胞表面受體結(jié)合的，指導(dǎo)病毒感染特異的靶細(xì)胞。帶有目的基因的載體如何到達(dá)“靶細(xì)胞”是腫瘤基因治療的關(guān)鍵。只有提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性，才能實(shí)現(xiàn)治療的針對(duì)性和安全性，目前國(guó)際上解決基因的靶向轉(zhuǎn)移及表達(dá)有三種策略：

基因治療的“靶細(xì)胞”或“靶組織”選擇問(wèn)題第一種方法是以基因工程手段改造基因載體，如改造逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞中的原病毒序列，使所包裝的重組病毒特異地識(shí)別位于靶細(xì)胞表面的抗原或受體決定簇；

第二種方法是在體內(nèi)基因傳遞系統(tǒng)中共價(jià)連接抗瘤抗體和腫瘤細(xì)胞特異受體的配基，使基因在類(lèi)似“生物導(dǎo)彈”作用下被送到腫瘤細(xì)胞表面

第三種方法是應(yīng)用腫瘤細(xì)胞特異蛋白“管家基因”的基因表面調(diào)控元件，在