DB21-T 3787-2023 非洲豬瘟病毒LAMP目視檢測方法

ICS11.220CCSB4121IDB21/T3787—2023前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 5生物安全基本要求 6方法原理 7設(shè)備、試劑和材料 28檢測步驟 2附錄A（規(guī)范性）溶液制備 4DB21/T3787—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心、中聯(lián)瑞（北京）生物科技有限責(zé)任公司。本文件主要起草人：蘭德松、于本良、顧貴波、曹際娟、周維、趙培、葛忠源、張雅為、孫世宇、楊作豐、劉賀、楊國麗、張春姝。本文件發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復(fù)并認真處理，根據(jù)實際情況依法進行評估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（沈陽市沈北新區(qū)人和街95號），聯(lián)系電話1DB21/T3787—2023非洲豬瘟病毒LAMP目視檢測方法本文件規(guī)定了非洲豬瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）LAMP目視檢測方法的生物安全基本要求，方法原理，設(shè)備、試劑和材料，檢測步驟等技術(shù)內(nèi)容。本文件適用于非洲豬瘟的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬全血、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟、骨髓、拭子等樣品中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。ASFV：非洲豬瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）Bst：嗜熱硬脂芽孢桿菌（BacillusStearothermophilus)DEPC：焦炭酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate）EDTA-2Na：乙二胺四乙酸二鈉（EthyleneDiaminetetraaceticAcidDisodium）LAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediatedIsothermalAmplification）RM：反應(yīng)液（ReactionMaterial）5生物安全基本要求進行ASFV檢測活動時，應(yīng)按照GB19489規(guī)定執(zhí)行。6方法原理針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，并引入環(huán)引物加快反應(yīng)，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶等在60℃~65℃進行恒溫擴增，15min～60min左右即可實現(xiàn)109倍～1010倍的核酸擴增。在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，經(jīng)鈣黃綠素染色，呈現(xiàn)綠色肉眼可見的沉淀物。2DB21/T3787—20237設(shè)備、試劑和材料7.1設(shè)備二級生物安全柜、高速臺式冷凍離心機、組織研磨儀、冰箱（2℃~8℃和-20℃以下）、金屬浴或恒溫水浴鍋（25℃~100℃)、微量移液器（量程：0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μ7.2試劑ASFVLAMP擴增用引物、2×反應(yīng)液（RM）、Bst2.0DNA聚合酶、熒光染料、陽性對照、陰性對照、DEPC處理水。試劑的溶液制備見附錄A。7.3材料核酸提取試劑盒、離心管（15mL、1.5mL）、0.2mLPCR反應(yīng)管、移液器吸頭（10μL、200μ8檢測步驟8.1樣品采集準(zhǔn)備8.1.1采樣人員符合NY/T541-2016中的規(guī)定。8.1.2采樣工具和器材符合NY/T541-2016中的規(guī)定。8.2樣品采集8.2.1血液樣品：按照NY/T541-2016中第6.1條中豬血液樣品采集的要求進行，將采集的血液注入含1/10體積4%EDTA-2Na溶液的無菌容器中，充分混勻，編號備檢。8.2.2臟器、組織樣品：按照NY/T541-2016中第6.2條和6.3條中的要求進行，將采集的病死豬或剖殺豬主要臟器（脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟等）、骨髓等樣品使用組織研磨儀或研缽在二級生物安全柜內(nèi)進行研磨處理后用于核酸提取。8.2.3拭子樣品：按照NY/T541-2016中相關(guān)要求進行。8.3樣品保存、包裝和廢棄物處理按照NY/T541-2016執(zhí)行。8.4樣品運輸按照NY/T541-2016執(zhí)行。8.5DNA提取DNA提取應(yīng)在樣本制備區(qū)內(nèi)進行，采用商品化核酸提取試劑盒按說明書提取樣本核酸，樣本核酸在-20℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?DB21/T3787—20238.6LAMP擴增反應(yīng)8.6.1體系的配制和分裝在試劑配制區(qū)進行。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n=待測樣品數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照）。按n+1計算好各試劑的使用量，按表1配制，加入1.5mL離心管中，充分混勻后，按23μL/管分裝至PCR管并編號。表1每個反應(yīng)體系配制表8.6.2加樣向上述編號的PCR管中分別加入制備的陰性對照核酸、陽性對照核酸和樣本核酸各2μL，扣緊混勻后，采用1s×3次的方式瞬時離心，之后轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。8.6.3PCR擴增檢測在PCR擴增區(qū)進行。將PCR反應(yīng)管放入金屬浴或恒溫水浴鍋等設(shè)備中，設(shè)置溫度63℃,時間55min。8.7結(jié)果判定8.7.1質(zhì)量控制自然光下，陽性對照為綠色熒光，陰性對照為橘黃色無熒光，則試驗成立。8.7.2結(jié)果判定自然光下，看到綠色熒光、淡綠色熒光、淺綠色熒光，判為陽性；看到橘黃色無熒光，判為陰性。4DB21/T3787—2023（規(guī)范性）溶液制備A.1引物的名稱和序列引物的名稱和序列見表A.1。表A.1引物名稱和序列AGGGGTTACAAACAGGTTATTGATGGGAGTCATTAATGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTATTGTTGGTGA.2引物混合物的制備取引物對（內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、外引物F3、外引物B3、環(huán)引物L(fēng)B）干粉，按引物說明書分別加入適量無菌純化水，溶解混勻，得到各引物溶液，置-20℃保存。A.32×反應(yīng)液（RM）的制備本方法采用的2×反應(yīng)液（RM）為商品化的2×反應(yīng)液（RM）。A.4Bst2.0DNA聚合酶的制備本方法采用的Bst2.0DNA聚合酶為商品化的Bst2.0DNA聚合酶。A.5熒光染料的制備本方法采用的熒光染料為商品化的熒光目視檢測試劑。A.6陽性對照采用核酸蛋白