PCR實驗及結(jié)果分析

PCR技術(shù)及其應(yīng)用2021/6/281目錄PCR技術(shù)歷史PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用2021/6/282PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長2021/6/283PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物2021/6/284PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶2021/6/285PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……2021/6/286PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎2021/6/287PCR技術(shù)簡介-定義

PCR:polymerasechainreaction

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR技術(shù)是一種體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴增技術(shù)，亦稱為無細(xì)胞分子克隆技術(shù)。它是以待擴增的兩條DNA鏈為模板，在一對人工合成的寡核苷酸引物的介導(dǎo)下，通過耐高溫DNA聚合酶的酶促作用，快速特異地擴增出特定的DNA片斷。簡單的講，PCR技術(shù)即通過引物延伸核酸的某個區(qū)域而進行的重復(fù)雙向DNA合成。2021/6/2882021/6/2892021/6/2810

PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3'端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。2021/6/2811PCR技術(shù)簡介PCR反應(yīng)所用酶：早期的PCR方法采用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片斷催化退火的寡核苷酸引物進行延伸反應(yīng)。由于該酶會在進行DNA變性的溫度下失活，所以在每一輪合成反應(yīng)中都須重新加1份酶。并且在擴增較長模板是效果不夠理想，產(chǎn)率較低，有一些錯配，導(dǎo)致產(chǎn)物大小不均一。耐熱DNA聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌－嗜熱水生菌種提純出來的，經(jīng)95℃持續(xù)溫育仍有活性，不會在加熱變性中失活，故無需每輪反應(yīng)都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和變性可以在更高溫度下進行，使引物和模板間的誤配大大減少，提高了擴增反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率，并且可以擴增更長的產(chǎn)物。2021/6/2812Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040202021/6/281372℃94℃55℃PCR循環(huán)2021/6/28141234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2021/6/28152021/6/2816

PCR中后期，隨著目的DNA擴展產(chǎn)物逐漸積累，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，DNA擴增產(chǎn)物的增加減慢，進入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即為停滯效應(yīng)，又稱平臺期。

2021/6/2817操作方法1在PCR反應(yīng)管中加入buffer2.5ul2向PCR加入dntp0.5ul3加入primer0.5ul4加入模板0.5ul5加酶0.5ul6加水20.5ul，至總體積為25微升？按緊蓋子，輕輕混勻，放入PCR儀如何加樣才能加得準(zhǔn)？2021/6/28185反應(yīng)條件94℃2-5分鐘94℃40sec57℃40sec72℃1min30sec72℃10min30-35cycle2021/6/2819電泳緩沖液的配制50×TAEBuffer配制方法：

1稱量Tris242g，Na2EDTA.2H2O37.2g于1L燒杯中；2向燒杯中加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；4。用NaOH調(diào)pH至8.3，加去離子水定容至1L后，室溫保存。使用時稀釋50倍即1×TAEBuffer1.5%2021/6/2820電泳按照5份PCR產(chǎn)物與一份6×loadingbuffer混合，取10-15ul混合液加入膠中，其中一孔加一份Marker對照，電泳，電壓120，電泳半個小時，放入EB染色液中，染色半個小時，。2021/6/2821PCR技術(shù)簡介PCR常見問題：一.出現(xiàn)假陰性；二.出現(xiàn)假陽性；三.出現(xiàn)非特異性擴增帶；四.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶。2021/6/2822PCR技術(shù)簡介一.PCR出現(xiàn)假陰性原因：

1．模板因素：

2．酶失活：

3．引物：

4．Mg2+濃度：

5．反應(yīng)體積的改變：

6．物理原因：

7．靶序列變異：2021/6/2823PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案模板因素：（1）模板中含有雜蛋白；（2）模板中含有Taq酶抑制劑；（3）模板中蛋白質(zhì)殘留，特別是染色體中的組蛋白殘留；（4）提取制備模板時丟失過多；（5）模板核酸變性不徹底。2021/6/2824PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案模板因素引起假陰性解決方案：1.配制有效而穩(wěn)定的消化處理液;2.提取程序固定,不宜隨意改動；3.模板DNA的溶解液應(yīng)固定不變。2021/6/2825PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案酶失活：1.酶本身的質(zhì)量問題(供應(yīng)商的問題）；2.酶存放時間太長；3.酶存放方式不當(dāng)，或其他意外原因；4.忘記添加Taq酶。2021/6/2826PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案酶失活引起假陰性解決方案：1.檢查加樣程序及過程，看是否忘記加Taq酶；2.更換新的Taq酶;3.新舊兩種Taq酶同時使用。2021/6/2827PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案引物：1.引物質(zhì)量；2.引物濃度；3.兩條引物的濃度是否對稱等。

2021/6/2828PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案引物引起假陰性解決方案:1.選定一個好的引物合成單位;2.引物濃度不僅要看OD值，稀釋時更要平衡其摩爾濃度；3.引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止反復(fù)凍融或長期冷凍保存，導(dǎo)致引物的變質(zhì)降解失效，也可要求合成單位將固體分裝；4.引物設(shè)計不合理，如長度不夠，引物本身或兩條引物之間形成二聚體等。2021/6/2829PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案

Mg2+濃度：

Mg2+濃度對PCR擴增效率影響極大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性；濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗，出現(xiàn)假陰性。2021/6/2830PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案Mg2+濃度引起假陰性解決方案：設(shè)置一組反應(yīng)，其中每一反應(yīng)中的其他離子濃度相同（如Tris.Cl,KCl等），而MgCl2濃度不同（由0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)，由此來摸索最佳Mg2+濃度。2021/6/2831PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案反應(yīng)體積的改變：

做小體積PCR后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，而非簡單地將反應(yīng)體系中的各個成分加大幾倍，否則易失敗。2021/6/2832PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案

物理原因：1.變性溫度低，變性時間短；2.退火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率；3.延伸時間過短等。2021/6/2833PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案物理原因引起假陰性解決方案：1.提高變性溫度，延長變性時間，特別是首次循環(huán)，必要時可設(shè)為95℃

，10min，或PCR反應(yīng)以前在開水中煮沸幾分鐘。2.退火溫度應(yīng)根據(jù)Tm值來設(shè)定，也可首先將退火溫度設(shè)為45℃

，然后再逐次提高（以2℃/次為宜）。3.延伸溫度以1000bp/min足夠，必要時也可適當(dāng)延長，特別是末次循環(huán)，一定要延伸10min。2021/6/2834PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案

靶序列變異：靶序列變異導(dǎo)致假引性的情況常常發(fā)生在靶序列變異正好發(fā)生于特異性引物與之結(jié)合部的中間，使引物失效。解決方案：根據(jù)已知序列重新選擇區(qū)段設(shè)計引物。2021/6/2835PCR技術(shù)簡介二.PCR出現(xiàn)假陽性原因：1.引物設(shè)計不合適；2.靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染。（1）整個基因組或大片段的污染；（2）空氣中的小片斷核酸污染。

2021/6/2836PCR出現(xiàn)假陽性原因分析及解決方案引物設(shè)計不合適：

1.選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，從而擴增出非目的性序列的PCR產(chǎn)物。2.靶序列太短或引物太短導(dǎo)致特異性不強。解決方案：

選擇特異性強的區(qū)段設(shè)計引物。2021/6/2837PCR出現(xiàn)假陽性原因分析及解決方案整個基因組或大片段的污染的解決方案：1.操作時小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管污染環(huán)境。2.除酶及不耐熱物品外，所有試劑及耗材均應(yīng)高溫高壓消毒，所用離心管及槍頭均應(yīng)一次性使用。3.必要時，加樣本前，反應(yīng)管及試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。2021/6/2838PCR出現(xiàn)假