2025屆高考生物二輪專題復(fù)習(xí)與測(cè)試板塊六生物技術(shù)與工程命題最前沿十三PCR與電泳的原理及應(yīng)用

[命題最前沿十三]PCR與電泳的原理及應(yīng)用1．PCR(1)PCR考點(diǎn)總結(jié)精華——應(yīng)對(duì)高考至少應(yīng)該掌握的知識(shí)點(diǎn)①PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，原理是DNA半保留復(fù)制。所需條件包括模板、原料(4種脫氧核苷酸)、引物(2種)和耐高溫的DNA聚合酶。其實(shí)質(zhì)是在體外對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。②用PCR儀控制溫度：加熱變性破壞氫鍵(超過(guò)90℃)→復(fù)性(50℃左右)→延伸(72℃左右)，需在耐高溫的DNA聚合酶(不需要解旋酶、限制酶、DNA連接酶)的作用下進(jìn)行。三步反應(yīng)完成后，兩引物間固定長(zhǎng)度的DNA序列在PCR擴(kuò)增3次后首先出現(xiàn)，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子數(shù)目就以2n的形式增加。③利用PCR擴(kuò)增目的基因(如干擾素基因)時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是有一段已知目的基因(干擾素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段單鏈DNA。復(fù)制方向是沿子鏈5′→3′，當(dāng)擴(kuò)增4次，共產(chǎn)生16個(gè)DNA時(shí)，消耗30個(gè)引物。(2)PCR中“引物”歸類分析①引物的作用：TaqDNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，TaqDNA聚合酶就能從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈。不同引物可結(jié)合不同的目的基因并進(jìn)行擴(kuò)增。②設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循的主要原則a．引物長(zhǎng)度應(yīng)大于16個(gè)核苷酸，可防止隨機(jī)結(jié)合。b．引物與靶序列間的Tm(指當(dāng)50%的引物和靶序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度)不應(yīng)過(guò)低。c．引物不應(yīng)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即不能有4bp以上的回文序列。d．2個(gè)引物間不應(yīng)有4bp以上的互補(bǔ)序列或同源序列。e．引物中堿基的分布應(yīng)盡可能均勻，G＋C含量接近50%。③引物的處理由于引物延伸從3′端開(kāi)始，3′端不能進(jìn)行任何修飾，引物5′端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可給予修飾而不影響擴(kuò)增特異性。引物5′端修飾包括加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、熒光等。為了使經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的基因能與載體正常結(jié)合，需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識(shí)別序列。其目的是保證目的基因定向插入載體并避免目的基因自身環(huán)化。(3)PCR循環(huán)時(shí)與引物相關(guān)的計(jì)算PCR經(jīng)過(guò)n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA數(shù)為2n，一共有2n＋1條鏈，其中有2條鏈?zhǔn)荄NA母鏈，不含引物，其他的每1條鏈均含1個(gè)引物，并且2種引物的數(shù)量相等，故PCR過(guò)程經(jīng)過(guò)n次循環(huán)，需要的引物總個(gè)數(shù)是2n＋1－2，需要某一種引物的總個(gè)數(shù)是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一個(gè)DNA由1條母鏈和第1種引物延伸的子鏈組成，另一個(gè)DNA由另1條母鏈和第2種引物延伸的子鏈組成，其他的DNA均由2種引物延伸的2條子鏈組成。2．電泳的原理及應(yīng)用DNA電泳是基因工程中最基本的技術(shù)。近年來(lái)基于DNA電泳圖譜分析與比較，結(jié)合高中所學(xué)的基因診斷、DNA指紋技術(shù)以及基因克隆等相關(guān)內(nèi)容的遺傳學(xué)試題較為常見(jiàn)。以遺傳學(xué)基本知識(shí)為背景，以DNA電泳圖譜為情境，強(qiáng)調(diào)情境與立意相結(jié)合，體現(xiàn)高考能力考核目標(biāo)和要求，很好地考查學(xué)生的獲取與處理表達(dá)信息能力和應(yīng)用分析能力。(1)DNA電泳原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。(2)蛋白質(zhì)電泳原理蛋白質(zhì)電泳常用方法是SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。(3)電泳的應(yīng)用電泳技術(shù)已廣泛用于核酸等成分的分離和鑒定。核酸的電泳條帶只表示它們的種類，不表示數(shù)量，不同條帶代表分子量不同的片段。1．某二倍體動(dòng)物種群有100個(gè)個(gè)體，其常染色體上某基因有A1、A2、A3三個(gè)等位基因。對(duì)這些個(gè)體的基因A1、A2、A3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳及統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖所示。該種群中A3的基因頻率是(B)A．52%B.27%C.26%D.2%解析：分析題圖可知，該動(dòng)物種群個(gè)體數(shù)為100個(gè)，其中有2個(gè)個(gè)體的基因型為A3A3，15個(gè)個(gè)體的基因型為A1A3，35個(gè)個(gè)體的基因型為A2A3，則A3的基因頻率＝(2×2＋15＋35)÷(100×2)×100%＝27%，B符合題意。2．亞洲棉的突變型光籽和野生型毛籽是一對(duì)相對(duì)性狀，研究發(fā)現(xiàn)，亞洲棉某突變體的光籽表型與8號(hào)染色體的～880kb至～903kb區(qū)間相關(guān)，研究人員根據(jù)野生型毛籽棉的該區(qū)間設(shè)計(jì)連續(xù)的重疊引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果如下圖所示，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(A)A．應(yīng)提取該突變體和野生型亞洲棉的全部染色體DNA進(jìn)行PCRB．上圖中PCR產(chǎn)物的鑒定是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行的C．據(jù)圖分析可知，分子量較大的擴(kuò)增產(chǎn)物與點(diǎn)樣處的距離較小D．該突變體出現(xiàn)的根本原因是第6對(duì)引物對(duì)應(yīng)區(qū)間發(fā)生了基因突變3．某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3—GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是(B)A．Gata3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制GFP基因表達(dá)B．翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3—GFP基因純合子D．若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子解析：由圖甲可知，Gata3基因與GFP基因共用一個(gè)啟動(dòng)子，且由題干可知兩基因能正常表達(dá)出相關(guān)蛋白質(zhì)，A錯(cuò)誤；由于啟動(dòng)子在左側(cè)，基因在右側(cè)，轉(zhuǎn)錄基因時(shí)，先轉(zhuǎn)錄Gata3基因，再轉(zhuǎn)錄GFP基因，由于翻譯的方向是沿mRNA的5′→3′，因此翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；由圖乙可知，大片段包含GFP基因編碼區(qū)片段，小片段不包含GFP基因編碼區(qū)片段，則2號(hào)小鼠是Gata3—GFP基因純合子，4號(hào)小鼠是野生型，C錯(cuò)誤；若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，雜合子和Gata3—GFP基因純合子均能擴(kuò)出條帶，僅有Gata3基因時(shí)無(wú)法擴(kuò)出條帶，不利于區(qū)分雜合子和純合子，D錯(cuò)誤。4．構(gòu)筑病毒防線需要兩種措施：一種是病毒檢測(cè)，以阻斷傳播途徑；另一種是疫苗研制，以增強(qiáng)人體免疫力。常采用RT-PCR技術(shù)(逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR技術(shù))檢測(cè)多種病毒感染。該技術(shù)的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處時(shí)會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)記錄到熒光信號(hào)，即每個(gè)熒光探針被水解就有一個(gè)熒光信號(hào)生成并被準(zhǔn)確記錄(如下圖)?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)PCR反應(yīng)體系中需要添加模板、原料、酶、引物等，其中引物的作用是使TaqDNA聚合酶能夠從引物的________端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。從理論上推測(cè)，PCR擴(kuò)增1個(gè)目的基因至第六輪循環(huán)結(jié)束，共記錄到________個(gè)熒光信號(hào)，第六輪循環(huán)將消耗________個(gè)引物1。(2)根據(jù)某病毒核酸序列設(shè)計(jì)的引物1為GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT，______(填“能”或“不能”)依據(jù)此序列設(shè)計(jì)出引物2的序列。如果待測(cè)樣本中沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，初步推測(cè)樣本中________(填“含有”或“不含有”)相應(yīng)病毒。答案：(1)3′6332(2)不能不含有5．苯丙酮尿癥是由PKU基因突變引起的，基因定點(diǎn)整合可以將正常PKU基因定點(diǎn)整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細(xì)胞的染色體DNA上，替換突變基因，用于研究該病的治療?；蚨c(diǎn)整合的過(guò)程是從染色體DNA的突變PKU基因兩側(cè)各選擇一段DNA序列HB1和HB2，根據(jù)其堿基序列分別合成HB1和HB2，再將兩者分別與基因K1、K2連接，中間插入正常PKU基因和標(biāo)記基因neor，構(gòu)建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發(fā)生交換，導(dǎo)致兩者之間區(qū)域發(fā)生互換(如下圖)?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)構(gòu)建重組載體時(shí)，需采用PCR對(duì)PKU基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)，需要先加熱超過(guò)90℃使DNA解聚為單鏈，后冷卻至50℃左右的目的是_____________________________。(2)重組載體中的HB1和HB2之間除了插入正常的PKU基因和neor基因以外，還必須含有________。neor基因的作用是________________________________________。(3)用圖中重組載體轉(zhuǎn)化時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一些PKU基因錯(cuò)誤整合的胚胎干細(xì)胞。錯(cuò)誤整合時(shí)，載體的兩個(gè)K基因中至少會(huì)有一個(gè)與neor基因一起整合到染色體DNA上，已知含有neor基因的細(xì)胞具有G418的抗性。K1、K2的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡。根據(jù)上述信息，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)要的實(shí)驗(yàn)方案從轉(zhuǎn)化的胚胎干細(xì)胞中篩選出正確整合的胚胎干細(xì)胞。_______________________________________________。答案：(1)使引物結(jié)合到互補(bǔ)的DNA鏈上(2)啟動(dòng)子、終止子鑒定與篩選含有正常PKU基因的胚胎干細(xì)胞(3)在含G418和DHPG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的胚胎干細(xì)胞，能夠存活的即為正確整合的胚胎干細(xì)胞6．定點(diǎn)誘變技術(shù)是近年來(lái)生物工程研究中發(fā)展迅速的一個(gè)領(lǐng)域。通過(guò)定點(diǎn)誘變可以在體外改造目的DNA分子，進(jìn)而研究基因的表達(dá)以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。經(jīng)典的大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)成為基于PCR的定點(diǎn)誘變技術(shù)中應(yīng)用最普遍的方法，操作過(guò)程如圖甲。研究者欲改造某基因并將其導(dǎo)入大腸桿菌的質(zhì)粒中保存，該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)如圖乙?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)利用大引物PCR進(jìn)行定點(diǎn)誘變需要進(jìn)行兩輪PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要________個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板。在PCR2中，要獲得帶有誘變點(diǎn)的改良基因，引物應(yīng)選用大引物兩條鏈中的________(填“①”或“②”)。(2)為實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒和改良基因的高效連接，選用限制酶XmaⅠ而不選用限制酶SmaⅠ的原因是__________________________________________________。為將改良基因構(gòu)建在質(zhì)粒上，還需要______________________________等酶。(3)在構(gòu)建改良基因表達(dá)載體時(shí)，有的質(zhì)粒含有改良基因，有的質(zhì)粒為空白質(zhì)粒，將含上述元件的溶液加入大