《牛子宮內(nèi)膜炎診斷與防治技術(shù)規(guī)程》

ICS01.040.65

CCSB04TB

團體標準

T/NAIA×××-××××

牛子宮內(nèi)膜炎診斷與防治技術(shù)規(guī)程

Technicalregulationsfordiagnosis,preventionandtreatmentof

bovineendometritis

(征求意見稿)

××××-××-××發(fā)布××××-××-××實施

寧夏化學分析測試協(xié)會發(fā)布

發(fā)布

牛子宮內(nèi)膜炎診斷與防治技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了牛子宮內(nèi)膜炎診斷與防治技術(shù)的術(shù)語和定義、診斷、預防和治療。

本文件適用于規(guī)模化牛場子宮內(nèi)膜炎的防治。其他牛場參照執(zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用

文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）

適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。

GB/T39759實驗動物術(shù)語。

GB/T14926.42實驗動物細菌學檢測標本采集。

GB/T14926.43實驗動物細菌學檢測染色法、培養(yǎng)基和試劑。

NY/T3234PCR檢測方法。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1牛子宮內(nèi)膜炎Bovineendometritis

是指母牛分娩時或產(chǎn)后由于致病性病原微生物感染或胎衣不下、難產(chǎn)等產(chǎn)科疾病或環(huán)境因素、

圍產(chǎn)期營養(yǎng)調(diào)控水平等因素引起的子宮黏膜炎癥。

3.2MHA培養(yǎng)基Mueller-HintonAgar

是一種廣泛用于細菌抗菌敏感性測試(AST)的培養(yǎng)基。

3.3麥康凱培養(yǎng)基MacConkeyAgarMedium

具有中等強度選擇性，主要抑制革蘭陽性菌，用于分離鑒定細菌的培養(yǎng)基。

3.4伊紅美藍培養(yǎng)基EosinMethyleneBlueAgar

一般用于檢測大腸桿菌。

3.5KF鏈球菌培養(yǎng)基KFStreptococcousAgar

主要用于多種病原菌的分離和培養(yǎng)。

4診斷

4.1流行病學

牛子宮內(nèi)膜炎主要是病原感染、飼養(yǎng)管理、環(huán)境衛(wèi)生、機械性損傷、營養(yǎng)因素、操作技術(shù)等可

誘發(fā)牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生。（發(fā)病原因見附錄A）

4.1.1感染途徑

病原菌侵入子宮的途徑可分為上行性感染(陰道感染)和下行性感染(血源性或淋巴源性感染)兩

種，但以上行性感染較為常見。

4.1.2易感性群體

分娩過程中或者分娩之后的牛易感。

4.2臨床癥狀

臨床癥狀分為四種（具體見附件A）：急性化膿性子宮內(nèi)膜炎；黏液膿性子宮內(nèi)膜炎；隱性子

宮內(nèi)膜炎；慢性膿性子宮內(nèi)膜炎。

4.3病理變化

切開子宮時，可見子宮腔內(nèi)積有混濁、數(shù)量不等、粘稠而呈灰白色滲出物，或混有血液而呈褐

紅色的滲出物，子宮內(nèi)膜有時出血和水腫，呈彌漫性或局灶性潮紅腫脹，其中有散在性出血點和出

血斑；重癥有時可見子宮阜充血（見附錄C）。鏡下：初期黏膜毛細血管充血和滲出，黏膜淺層的

子宮腺管周圍或腺腔內(nèi)有明顯的中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞的浸潤。黏膜上皮和部分淺層子

宮腺管上皮細胞，發(fā)生變性壞死脫落，可有紅細胞和纖維素滲出(假膜形成)（見附錄C）

4.4子宮內(nèi)膜炎診斷方法：

4.4.1直腸檢查

通過觸摸直腸，子宮角增大，子宮壁增厚，子宮呈面團樣感覺，子宮收縮反應減弱，子宮體有

波動感。慢性子宮內(nèi)膜炎的子宮壁增厚，彈性減弱，厚薄不均勻。

4.4.2陰道檢查

進行陰道觸診檢查前，先將牛外陰清洗干凈，觸診者手帶干凈手套，涂滿潤滑劑，后伸入牛陰

道，至少停留30s以上，對側(cè)面、腹面和背面陰道壁至宮頸口進行觸診，退出時對陰道內(nèi)的性狀和

粘液量進行檢查。子宮頸腫脹充血，有觸痛，則為急性子宮內(nèi)膜炎；子宮頸松弛，黏膜充血，宮頸

口張開，有白色、灰白色或淡黃色的黏稠滲出物流出，則為慢性子宮內(nèi)膜炎。

4.4.3B型超聲波診斷

2

通過將探頭伸入直腸對子宮進行超聲探查，對子宮內(nèi)膜厚度，子宮角直徑，卵巢等進行觀察，

判斷子宮內(nèi)是否有積液及積液量。子宮發(fā)生炎癥時，宮腔膨脹，輪廓不清并伴有部分回聲，存在片

狀物。

4.4.4實驗室診斷

4.4.4.1樣本采集

采集子宮分泌物的用具嚴格消毒。先用溫水清洗患子宮內(nèi)膜炎的牛外陰部位，再用0.1%新潔爾

滅溶液消毒，然后按直腸把握法把輸精管送入子宮，用一次性注射器通過輸精管抽取子宮分泌物1～

2mL，立即注入備好的無菌瓶內(nèi)，封蓋，標記，冷藏保存。如果24h內(nèi)不能送達實驗室，-20℃保存

待用。樣品解凍時，置于38℃～40℃水浴解凍。

4.4.4.2分離培養(yǎng)

綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、MHA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基和KF鏈球菌培養(yǎng)基，實驗

用水應符合GB/T6682規(guī)定。

取子宮分泌物，涂于5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上，并對其進行劃線，放入37℃恒溫箱培養(yǎng)18h～24h

后。觀察菌落的狀態(tài)，根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色等進行大致分類，然后在顯微鏡下觀察細菌的

形態(tài)、革蘭氏染色特點仔細進行分類。將挑選出來的細菌進一步純培養(yǎng)。純化培養(yǎng)物作革蘭氏染色

（見附錄D）、鏡檢，根據(jù)不同的培養(yǎng)特征、染色形態(tài)特征和其生化鑒定（見附錄E）來綜合判定。

4.4.4.3PCR鑒別診斷

4.5結(jié)果判定

符合4.1、4.2、4.3的特征判斷為疑似病例。

同時符合4.4的特征判斷為確診病例。

5預防和治療

5.1預防

預防性清宮：在母牛產(chǎn)后，無論是否發(fā)病，提前用藥物灌注、肌注，去干預或預防子宮內(nèi)膜炎

的發(fā)生，預防時機在產(chǎn)后前三天為宜。

治療性清宮：惡露的清洗，用0.1%的高錳酸鉀溶液，灌注抗生素，如鏈霉素、林可霉素等，注

射縮宮素，通過促進子宮的收縮，來促進子宮惡露的排除。

綜合預防：日常加強飼養(yǎng)管理，遵守操作規(guī)程，定期消毒，定期監(jiān)測。避免從病發(fā)較高的地區(qū)

引進母牛，且牛群引進后應隔離觀察并采取應激預防措施，確保無病后方可混群。加強母牛產(chǎn)前產(chǎn)

后護理，尤其注意產(chǎn)犢季節(jié)。合理控制溫、濕度、規(guī)范工作人員的操作、圍產(chǎn)前期科學飼養(yǎng)、一胎

雙犢的預防、規(guī)范接產(chǎn)、做好產(chǎn)后保健、以及合理利用智能設備。

5.2治療

5.2.1西藥治療

主要使用抗生素藥物，結(jié)合藥敏試驗進行治療，使用劑量參照說明書。

5.2.2中藥治療

可使用生化湯湯煎劑（組方：當歸、川穹、自芍、炮姜、蒲公英、金銀花、連翹、甘草）或者

健宮散等，療效較好。使用劑量參照說明書。

5.2.3中西藥聯(lián)合用藥治療

西藥選擇硫酸慶大霉素注射液，中藥選擇生化湯湯煎劑，使用劑量參照說明書。

5.2.4其他療法

子宮給藥治療，激素治療，微生物制劑治療等。

4

附錄A

（規(guī)范性附錄）

發(fā)病原因

A.1病原微生物感染

大部分為化膿桿菌、葡萄球菌和鏈球菌所引起其次為大腸桿菌、胎兒滴蟲、胎兒彎曲菌、壞死

桿菌和惡性水腫桿菌引起；結(jié)核桿菌、布氏桿菌及馬副傷寒流產(chǎn)桿菌也可引起子宮內(nèi)膜炎。另外，

一些真菌、病毒、支原體、霉形體和寄生蟲也會引起牛子宮內(nèi)膜炎。

A.2繼發(fā)因素

其他疾病繼發(fā)的產(chǎn)科疾病，例如難產(chǎn)、胎衣不下、陰道炎、子宮蓄膿、卵巢囊腫、陰道脫出；

人為的引產(chǎn)、助產(chǎn)、子宮檢查和剝離胎衣的過程中，容易造成牛產(chǎn)道的機械性損傷感染，引起子宮

內(nèi)膜炎；頻繁的人工輸精或灌注藥物會損傷子宮黏膜，子宮防御屏障被破壞，誘發(fā)子宮受到感染。

A.3環(huán)境因素

溫度過高、濕度大、衛(wèi)生條件差、空氣質(zhì)量不佳。

A.4營養(yǎng)和激素因素

圍產(chǎn)期飼養(yǎng)管理不當、飼料品質(zhì)不佳造成母牛營養(yǎng)代謝失調(diào)，如飼糧中缺乏維生素A和微量元

素硒導致子宮內(nèi)膜細胞角質(zhì)化增生；攝入的糖原、鈣、磷不足誘發(fā)胎衣不下，導致子宮內(nèi)膜炎。

A.5人工操作因素

工作人員未經(jīng)過科學的培訓，操作過程中未按規(guī)定操作，沒有嚴格消毒，操作粗魯，造成奶牛

子宮損傷以及污染，促使了病原微生物入侵。

臨床癥狀

A.6急性化膿性子宮內(nèi)膜炎

病牛表現(xiàn)精神沉郁，體溫升高、食欲減退、不時努責，從陰門中排出灰白色、含有絮狀或膿性

的分泌物，臥下時排出量較多。

A.7黏液膿性子宮內(nèi)膜炎

病牛精神沉郁，體溫略有升高，食欲減退，陰道檢查時可見黏膜充血、腫脹，從陰門不斷排

出少量白色膿性、混濁的分泌物，并污染病牛的尾根及后軀。

A.8隱性子宮內(nèi)膜炎

病牛無明顯癥狀，性周期、發(fā)情和排卵均正常，但屢配不孕，有的病牛雖已受孕但易發(fā)生流產(chǎn)。

發(fā)情時從陰道中流出較多的稍混濁的黏液。

A.9慢性膿性子宮內(nèi)膜炎

病牛往往表現(xiàn)全身癥狀。病牛性周期紊亂或不發(fā)情，有時伴有貧血和消瘦癥狀，常見到從病牛

陰門中排出膿性分泌物，尤其在臥下時排出較多，并常常在尾根及后軀形成結(jié)痂。

附錄B

（規(guī)范性附錄）

四種培養(yǎng)基的配制

B.1伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基

蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，磷酸氫二鉀2.0g，瓊脂15.0g，伊紅0.4g，美藍0.065g，溶于1000mL

蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，傾入無菌平皿，4℃保存。

B.2麥康凱培養(yǎng)基

蛋白胨20.0g，牛膽鹽5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂14.0g，乳糖10.0g，中性紅0.03g，加入蒸餾水

或去離子水1L，將上述成分混合，加熱溶解，校正pH，加入瓊脂，煮沸溶化后再加人中性紅溶液，

搖勻，115℃滅菌20min，待冷至50～55℃時傾注平皿。凝固后置4C冰箱保存，一周內(nèi)使用。

B.3KF鏈球菌培養(yǎng)基

蛋白胨10.0g，酵母粉10.0g，甘油磷酸鈉10.0g，氯化鈉5.0g，麥芽糖20.0g，乳糖1.0g，疊氮

鈉0.4g，瓊脂13.0g，溴甲酚紫0.015g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓15min，冷卻至

50～60℃時，加入無菌1%TTC溶液10mL，混勻，傾入無菌平皿，備用。

B.4MHA培養(yǎng)基

牛肉粉6.0g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，瓊脂17.0g，稱取本品加熱溶解于1000mL

蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，待冷至50℃，傾入無菌平皿，備用。

附錄C

病理剖檢子宮形態(tài)

C.1病理子宮剖檢眼觀形態(tài)

6

C.2局部病理子宮組織鏡下結(jié)構(gòu)

附錄D

（規(guī)范性附錄）

D.1革蘭氏染色：

1）涂片

2)晾干

3)固定手執(zhí)載玻片一端，菌膜朝上，通過火焰2-3次，固定。

4)結(jié)晶紫染色將載玻片置于廢液缸上，加適量（以蓋滿細菌涂面）的染液染色1min。

5)水洗傾去染色液，用水小心沖洗。

6)媒染滴加盧哥氏碘液，媒染1min。

7)水洗用水洗去碘液。

8)脫色傾斜載玻片，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20~25s，至流出液無色，立即水洗。

9)復染滴加石炭酸復紅染5min。

10)水洗用水洗去染色液。

11)晾干將染好的涂片放在空氣中晾干或者用吸水紙吸干。

12)鏡檢先低倍，后高倍，最后用油鏡觀察。

附錄E

（規(guī)范性附錄）

PCR診斷方法

E.1取4.4.4.2培養(yǎng)物2mL，12000r/min離心10min，用細菌基因組DNA提取試劑盒對沉淀物

進行基因組DNA的提取。以菌液DNA為模板，采用通用引物（16SrRNA），對細菌16SrRNA基因

進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序。引物序列如下：

16SF5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，

16SR5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，

E.250μL反應體系

反應條件如下：PCR反應體系為50μL體系：模板2μL，27F、1492R各1μL（20μmol/L），2×Taq

PCRMix25μL，ddH2O21μL；16SrRNAPCR反應條件為：95℃預變性5min，94℃變性50s，57℃

退火1min，72℃延伸90s，30個循環(huán)，72℃終延伸10min，4℃結(jié)束反應。

PCR擴增完成后，擴增的基因產(chǎn)物進行凝膠電泳試驗，將PCR擴增產(chǎn)物進行1%凝膠電泳，反應

條件：120V，30min。將帶有目的條帶的PCR擴增產(chǎn)物進行測序。

E.3測序后的序列結(jié)果通過NCBI進行BLAST序列比對，從而確定菌種。

附錄F

附錄F

（規(guī)范性附錄）

（1）革蘭氏染色試驗：細菌涂片用革蘭氏染色液進行染色后，顯微鏡下10×100倍觀察，革蘭

氏陽性細菌呈藍紫色，革蘭氏陰性細菌呈粉紅色。

（2）溶血試驗：用劃線法將待檢菌落接種于血液平板，置37℃培養(yǎng)18～24h后觀察，在菌落周

圍形成不透明的綠色輪暈為α型溶血；菌落周圍形成無色透明的溶血環(huán)為β型溶血；菌落周圍不產(chǎn)生

溶血現(xiàn)象的為γ型溶血。

（3）觸酶試驗：采用玻片法，在玻片上滴1滴無菌生理鹽水，用接種環(huán)挑取細菌在生理鹽水中

混勻，然后加1滴3％過氧化氫后進行觀察，有氣泡產(chǎn)生者為陽性（+）。做過氧化氫酶試驗不宜用

血瓊脂平板上的菌落，因紅細胞含有觸酶，會出現(xiàn)假陽性反應，最好用營養(yǎng)瓊脂或適宜培養(yǎng)基。做

8

觸酶試驗必須用18～24h的培養(yǎng)物，陳舊培養(yǎng)物可能失去觸酶活性，而出現(xiàn)假陰性。試驗用雙氧水

必須新鮮配制，否則也易導致假陰性。

（4）血漿凝固酶試驗：采用玻片法，于玻片上滴加1滴生理鹽水，挑取菌落浮于生理鹽水中，

然后滴加1滴兔血漿，混勻，若細菌凝集成塊為陽性（+）。

（5）三糖鐵試驗：用接種環(huán)挑取少量細菌，接種時先涂布斜面，后穿刺底層，置37℃恒溫箱培

養(yǎng)24h，觀察其反應情況。產(chǎn)酸（+）培養(yǎng)基變黃；產(chǎn)酸產(chǎn)氣（⊕）培養(yǎng)基變黃有氣泡；培養(yǎng)基變紅

（△）；硫化氫陽性或陰性反應（+/－）。

（6）CAMP試驗：在血液平板上先接種一條金黃色葡萄球菌的劃線，與此線垂直接種被檢的細

菌，在有金黃色葡萄球菌產(chǎn)物存在的情況下，可產(chǎn)生明顯溶血現(xiàn)象的為陽性（+）。

（7）6.5％NaCl試驗：用劃線法將菌種接種到NaCl平板瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)18～24h

后觀察結(jié)果，有細菌生長的為陽性反應（+）。

（8）硫化氫試驗：采用醋酸鉛瓊脂法，在融化的瓊脂內(nèi)加入硫代硫酸鈉溶液（先煮沸滅菌），

待涼至60℃，再加入醋酸鉛溶液，混合均勻，無菌分裝滅菌試管三指高，立即浸入冷水，使冷凝成

瓊脂高層。用接種針挑取培養(yǎng)物，沿試管壁作穿刺接種，37℃培養(yǎng)1～2d后觀察，培養(yǎng)基變黑色為

陽性（+）。

（9）尿素酶試驗：將待檢細菌接種到尿素酶生化管中，同時作劃線及接種穿刺，37℃恒溫培養(yǎng)

24h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基從黃色變紅色時為陽性（+）；繼續(xù)觀察4天仍不變色者為陰性（－）。

（10）檸檬酸鹽試驗：將少量被檢菌種接種到檸檬酸鹽固體斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)2～4

d，能利用檸檬酸鹽的細菌表現(xiàn)為有細菌生長，培養(yǎng)基變?yōu)樗{色者為陽性（+）；不能利用檸檬酸鹽

的細菌不能生長，培養(yǎng)基不變色為陰性（－）。

（11）吲哚（靛基質(zhì)）試驗：某些細菌有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)為

無色，加入對二甲基氨基苯甲醛試劑，可形成紅色的玫瑰靛基質(zhì)。將被檢菌接種于半固體瓊脂，

37℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)24～48h，沿管壁滴加歐氏試劑0.5mL，覆蓋于無癥狀物的表面。結(jié)果判定：陽

性在交界面出現(xiàn)紅色，陰性在交界面仍呈黃色。

（12）甲基紅（M.R）試驗：接種細菌于生化管培養(yǎng)液（含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨）中，

37℃恒溫培養(yǎng)2～7d，于培養(yǎng)物中加入幾滴甲基紅試劑，變紅色者為陽性反應（+）。