基因組測(cè)序的技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

基因組學(xué)共二百五十四頁(yè)

元素(yuánsù)周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀(jì)物理、化學(xué)研究和發(fā)展的基礎(chǔ)元素(yuánsù)周期表“基因組序列圖”將奠定二十一世紀(jì)生命科學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)！

“基因組”----生命科學(xué)的“元素周期表”人體解剖圖奠定了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)共二百五十四頁(yè)生命(shēngmìng)的奧秘蘊(yùn)藏于“四字天書(shū)”之中…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTCGCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT…共二百五十四頁(yè)基因組學(xué)

§1基因組學(xué)概述(ɡàishù)

§2基因組圖譜的構(gòu)建§3基因組測(cè)序§4功能基因組學(xué)共二百五十四頁(yè)基因組學(xué)概念(gàiniàn)及范疇

基因組(genome)是德國(guó)遺傳學(xué)家H.Winkler在1920年將gene（基因）和chromosome(染色體)兩個(gè)詞縮合而創(chuàng)造的一個(gè)新詞，意思是指染色體上的全部基因。幾十年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，其含義擴(kuò)展為在個(gè)體水平代表(dàibiǎo)一個(gè)個(gè)體所有遺傳性狀的總和，在細(xì)胞水平代表(dàibiǎo)一個(gè)細(xì)胞所有不同染色體（單倍體）的總和，在分子水平代表(dàibiǎo)一個(gè)物種所有DNA分子的總和。

共二百五十四頁(yè)基因組學(xué)概述(ɡàishù)基因組（genome），又稱染色體組一個(gè)物種單倍體的染色體數(shù)目(shùmù)，物種全部遺傳信息的總和物種遺傳信息的“總詞典”控制發(fā)育的“總程序”生物進(jìn)化歷史的“總檔案”共二百五十四頁(yè)基因組(genome)

基因組(genome)是德國(guó)遺傳學(xué)家H.Winkler在1920年將gene（基因）和chromosome(染色體)兩個(gè)詞縮合而創(chuàng)造的一個(gè)新詞，意思是指染色體上的全部基因。幾十年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，其含義擴(kuò)展為在個(gè)體水平(shuǐpíng)代表一個(gè)個(gè)體所有遺傳性狀的總和，在細(xì)胞水平(shuǐpíng)代表一個(gè)細(xì)胞所有不同染色體（單倍體）的總和，在分子水平(shuǐpíng)代表一個(gè)物種所有DNA分子的總和。

共二百五十四頁(yè)基因組學(xué)(genomics)就是發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測(cè)序新技術(shù)以及計(jì)算機(jī)程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能(gōngnéng)的科學(xué)。1986年提出，至今20年，已經(jīng)發(fā)展成為遺傳學(xué)中最重要的分支學(xué)科。對(duì)物種的所有基因進(jìn)行定位、作圖、測(cè)序和功能分析共二百五十四頁(yè)基因組學(xué)的基礎(chǔ)理論研究(yánjiū)基因組學(xué)是要揭示下述四種整合體系的相互關(guān)系:基因組作為信息載體

（堿基對(duì)、重復(fù)序列的整體守恒與局部不平衡的關(guān)系）基因組作為遺傳物質(zhì)的整合體

(基因作為功能和結(jié)構(gòu)單位與遺傳學(xué)機(jī)制的關(guān)系)基因組作為生物化學(xué)分子的整合體

(基因產(chǎn)物作為功能分子與分子、細(xì)胞機(jī)制的關(guān)系）物種進(jìn)化的整合體

(物種在地理(dìlǐ)與大氣環(huán)境中的自然選擇）共二百五十四頁(yè)

基因組學(xué)是一個(gè)(yīɡè)大學(xué)科“界門綱目科屬種”，地球上現(xiàn)存物種近億，所有生生滅滅的生物，無(wú)一例外，都有個(gè)基因組。基因組作為信息載體，它所儲(chǔ)存的信息是最基本的生物學(xué)信息之一；既是生命本質(zhì)研究的出發(fā)點(diǎn)之一，又是生物信息的歸宿?；蚪M學(xué)研究包括對(duì)基因產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄子組和蛋白質(zhì)組）的系統(tǒng)生物學(xué)研究?；蚨鄳B(tài)性的規(guī)?；芯烤褪腔蚪M多態(tài)性的研究?；蚪M學(xué)的研究必然要上升到細(xì)胞機(jī)制、分子機(jī)制和系統(tǒng)生物學(xué)的水平(shuǐpíng)?；蚪M的起源與進(jìn)化和物種的起源與進(jìn)化一樣是一個(gè)新的科學(xué)領(lǐng)域。基因組信息正在以天文數(shù)字計(jì)算，規(guī)?；胤e累，它的深入研究必將形成一個(gè)嶄新的學(xué)科。共二百五十四頁(yè)

基因組學(xué)是一門(yīmén)大科學(xué)基因組的信息是用來(lái)發(fā)現(xiàn)和解釋具有普遍意義的生命現(xiàn)象和它們的變化、內(nèi)在規(guī)律、和相互關(guān)系(guānxì)?；蚪M的信息含量高?；蚪M學(xué)的研究又在于基因組間的比較?；蚪M學(xué)的復(fù)雜性必然導(dǎo)致多學(xué)科的引進(jìn)和介入（各生物學(xué)科、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、化學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)、電子工程學(xué)、考古學(xué)等）?；蚪M學(xué)研究的手段和技術(shù)已經(jīng)走在生命科學(xué)研究的最前沿?；蚪M信息來(lái)自于高效率和規(guī)?；a(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。人類基因組計(jì)劃證明了基因組研究的迫切性和可行性。共二百五十四頁(yè)基因組與生命(shēngmìng)之謎基因組的產(chǎn)生(chǎnshēng)與進(jìn)化?；蚪MDNA組分的變化、GC百分比、嘌呤：嘧啶守恒。遺傳密碼的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)化。內(nèi)含子（尤其是大于100，000核苷酸的大內(nèi)含子）剪出后的運(yùn)輸和降解。最小內(nèi)含子的生物學(xué)意義。動(dòng)物基因組與植物基因組在基因分布上的共性和個(gè)性。物種衍變過(guò)程中基因組水平的變化?；蚪M大小變化與遺傳、分子、細(xì)胞機(jī)制的關(guān)系?！癑UNKDNA”的發(fā)生、分類、進(jìn)化與功能。共二百五十四頁(yè)基因組學(xué)研究(yánjiū)的最終目標(biāo)

獲得生物體全部基因組序列鑒定所有基因的功能明確(míngquè)基因之間的相互作用關(guān)系闡明基因組的進(jìn)化規(guī)律

共二百五十四頁(yè)經(jīng)典(jīngdiǎn)遺傳學(xué)

在20世紀(jì)初，遺傳學(xué)剛剛誕生的時(shí)候，遺傳學(xué)家的工作主要是鑒別感興趣的基因，確定這些基因在染色體上的位置。第一個(gè)環(huán)節(jié)：尋找自發(fā)突變體，或者利用(lìyòng)物理、化學(xué)因素誘發(fā)突變。第二個(gè)環(huán)節(jié)：通過(guò)連鎖分析確定新基因與已知基因的相互關(guān)系，繪制遺傳連鎖圖。共二百五十四頁(yè)幾個(gè)(jǐɡè)代表物種的基因組大小共二百五十四頁(yè)基因組學(xué)的分類(fēnlèi)3基因組學(xué)（根據(jù)(gēnjù)所研究的生物體種類分類）結(jié)構(gòu)基因組學(xué)功能基因組學(xué)1基因組學(xué)（根據(jù)系統(tǒng)特征分類）2基因組學(xué)（根據(jù)與其它學(xué)科的關(guān)系分類）基因組繪制和測(cè)序基因和基因組組織基因組調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)錄組學(xué)蛋白組學(xué)代謝組學(xué)基礎(chǔ)基因組學(xué)應(yīng)用基因組學(xué)生化基因組學(xué)遺傳基因組學(xué)進(jìn)化基因組學(xué)生理基因組學(xué)計(jì)算基因組學(xué)生態(tài)基因組學(xué)工業(yè)基因組學(xué)農(nóng)業(yè)基因組學(xué)環(huán)境基因組學(xué)醫(yī)學(xué)基因組學(xué)植物基因組學(xué)動(dòng)物基因組學(xué)人類基因組學(xué)微生物基因組學(xué)共二百五十四頁(yè)基因組學(xué)的研究(yánjiū)內(nèi)容

結(jié)構(gòu)(jiégòu)基因組學(xué)功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)共二百五十四頁(yè)結(jié)構(gòu)(jiégòu)基因組學(xué)（structuralgenomics）

基因定位(dìngwèi)基因組作圖測(cè)定核苷酸序列共二百五十四頁(yè)功能(gōngnéng)基因組學(xué)（functionalgenomics）

又稱后基因組學(xué)（postgenomics)

基因的識(shí)別、鑒定、克隆基因結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系基因表達(dá)調(diào)控(diàokònɡ)的研究共二百五十四頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）鑒定(jiàndìng)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用方式共二百五十四頁(yè)遺傳學(xué)與基因組學(xué)的里程碑

圖中所示的螺旋展示了遺傳學(xué)和基因組學(xué)重要進(jìn)展的里程碑，從孟德?tīng)栠z傳法則的發(fā)現(xiàn)和其在20世紀(jì)初被重新發(fā)現(xiàn)[1]開(kāi)始。DNA被確立是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]、DNA結(jié)構(gòu)的確定[3]、遺傳代碼的闡明[4]、DNA重組技術(shù)的發(fā)展[5，6]、以及自動(dòng)化程度日益提高(tígāo)的DNA測(cè)序技術(shù)的建立[7-10]，為1990年啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃（HGP）奠定了基礎(chǔ)共二百五十四頁(yè)研究功能(gōngnéng)基因組學(xué)的挑戰(zhàn)闡釋基因功能鑒別和表征生命的分子機(jī)構(gòu)描繪基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)(wǎngluò)系統(tǒng)水平上而非單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)生物系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)計(jì)算機(jī)上的挑戰(zhàn)多學(xué)科協(xié)作共二百五十四頁(yè)基因組的進(jìn)化(jìnhuà)（1）基因組大小的進(jìn)化包括基因組的含量、基因組的結(jié)構(gòu)(jiégòu)以及基因的數(shù)量等幾個(gè)方面。（2）基因組的分子進(jìn)化DNA序列的進(jìn)化：基因的不同區(qū)域進(jìn)化速率不同。內(nèi)含子中堿基對(duì)趨異進(jìn)化速率大于外顯子；編碼序列中同義突變的進(jìn)化速率大于非同義突變，非同義突變的進(jìn)化速率最低。假基因的進(jìn)化速率最高。共二百五十四頁(yè)

多基因家族的進(jìn)化(jìnhuà)：通過(guò)基因擴(kuò)增和不均等交換形成多拷貝基因，在通過(guò)突變積累、基因重排和自然選擇等因素形成多基因家族或新的基因。如珠蛋白基因家族的進(jìn)化(jìnhuà)。外顯子混編：來(lái)自(láizì)不同基因的多個(gè)外顯子相互連接，或基因內(nèi)部的外顯子重復(fù)。基因水平轉(zhuǎn)移：遺傳物質(zhì)從一個(gè)物種通過(guò)各種方式轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種的基因組中。如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、轉(zhuǎn)染等。共二百五十四頁(yè)范圍和一般(yībān)方法結(jié)構(gòu)(jiégòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)錄物組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)代謝物組學(xué)共二百五十四頁(yè)基因組學(xué)的發(fā)展(fāzhǎn)歷程年里程碑和事件參考文獻(xiàn)1985-1988美國(guó)科學(xué)院和研究委員會(huì)討論、辯論制定人類基因組計(jì)劃（HGP）Albers，19981990人類基因組計(jì)劃在美國(guó)正式開(kāi)始Burris，19981995第一個(gè)自由存活生物，Haemophiusinfluenzae鳥(niǎo)槍法測(cè)序完成Fleischmann，19951996芽殖酵母測(cè)序完成——第一個(gè)真核生物基因組Goffeau，199619981998第一個(gè)多細(xì)胞生物秀麗線蟲(chóng)測(cè)序完畢微陣列和基因組學(xué)一起列入最高十項(xiàng)科學(xué)突破C.Elegans，1998新聞編委會(huì)，19982000全基因組鳥(niǎo)槍法完成果蠅的全基因組測(cè)序Adams，20002000美國(guó)前總統(tǒng)克林頓宣布即將完成的HGP是人類描繪最奇妙的圖譜Marshall，20002000第一個(gè)模式植物擬南芥全基因組測(cè)序完成GenomeIntiative2001人類基因組序列草圖的兩個(gè)版本分別在nature和science上發(fā)表Venter，20012002兩個(gè)水稻亞種基因組序列草圖完成Yu，2002共二百五十四頁(yè)§2

基因組圖譜(túpǔ)的構(gòu)建基因組計(jì)劃的主要任務(wù)是獲得全基因組序列但是，現(xiàn)在的測(cè)序方法每次只能測(cè)800～1000bp大量的測(cè)序片段要拼接要知道序列在Chr上的位置才能正確拼接基因組計(jì)劃的第一個(gè)環(huán)節(jié)(huánjié)：構(gòu)建基因組圖譜共二百五十四頁(yè)基因組圖譜(túpǔ)遺傳(yíchuán)圖譜（geneticmap）物理圖譜（physicalmap）共二百五十四頁(yè)遺傳(yíchuán)圖譜（geneticmap）

采用遺傳(yíchuán)分析的方法將基因或其它DNA序列標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。共二百五十四頁(yè)遺傳(yíchuán)標(biāo)記有可以識(shí)別的標(biāo)記，才能確定目標(biāo)的方位及彼此之間的相對(duì)位置。構(gòu)建遺傳圖譜就是尋找基因組不同位置上的特征標(biāo)記。包括(bāokuò)：形態(tài)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記生化標(biāo)記

DNA分子標(biāo)記共二百五十四頁(yè)多態(tài)性（polymophism）所有的標(biāo)記都必須具有多態(tài)性！花色：白色、紅色株高：高、矮血型：A、B、O型淀粉：糯、非糯所有多態(tài)性都是基因突變(jīyīntūbiàn)的結(jié)果！共二百五十四頁(yè)形態(tài)(xíngtài)標(biāo)記形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等又稱表型標(biāo)記數(shù)量(shùliàng)少很多突變是致死的受環(huán)境、生育期等因素的影響共二百五十四頁(yè)

最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體(qūtǐ)的顏色、翅膀的形狀等形態(tài)性狀作為標(biāo)記，分析它們連鎖關(guān)系及遺傳距離，繪制而成的?？刂菩誀畹钠鋵?shí)是基因，所以形態(tài)標(biāo)記實(shí)質(zhì)上就是基因標(biāo)記。共二百五十四頁(yè)果蠅(ɡuǒyínɡ)連鎖圖共二百五十四頁(yè)細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(biāojì)明確顯示遺傳(yíchuán)多態(tài)性的染色體結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征染色體的核型染色體的帶型染色體的結(jié)構(gòu)變異染色體的數(shù)目變異優(yōu)點(diǎn)：不受環(huán)境影響缺點(diǎn)：數(shù)量少、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育不利共二百五十四頁(yè)生化(shēnɡhuà)標(biāo)記

又稱蛋白質(zhì)標(biāo)記(biāojì)就是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記。

如：同工酶、貯藏蛋白優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量較多，受環(huán)境影響小缺點(diǎn)：受發(fā)育時(shí)間的影響、有組織特異性、只反映基因編碼區(qū)的信息共二百五十四頁(yè)DNA分子(fēnzǐ)標(biāo)記簡(jiǎn)稱分子標(biāo)記以DNA序列的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)：不受時(shí)間和環(huán)境的限制遍布整個(gè)基因組，數(shù)量無(wú)限不影響性狀表達(dá)自然存在的變異(biànyì)豐富，多態(tài)性好共顯性，能鑒別純合體和雜合體共二百五十四頁(yè)限制性片段(piànduàn)長(zhǎng)度多態(tài)性

（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）

DNA序列能或不能被某一酶酶切，相當(dāng)于一對(duì)等位基因的差異。

如有兩個(gè)DNA分子（一對(duì)染色體），一個(gè)具有某一種酶的酶切位點(diǎn)，而另一個(gè)沒(méi)有這個(gè)位點(diǎn)，酶切后形成的DNA片段長(zhǎng)度(chángdù)就有差異，即多態(tài)性。可將RFLP作為標(biāo)記，定位在基因組中某一位置上。人類基因組中有105個(gè)RFLP位點(diǎn)，每一位點(diǎn)只有兩個(gè)等位基因。共二百五十四頁(yè)RFLP分析(fēnxī)共二百五十四頁(yè)RFLP標(biāo)記(biāojì)位共顯性標(biāo)記(biāojì)共二百五十四頁(yè)微衛(wèi)星（microsatellite）標(biāo)記(biāojì)微衛(wèi)星又稱為簡(jiǎn)單(jiǎndān)重復(fù)序列（simplesequencerepeat，SSR）。這種重復(fù)序列的重復(fù)單位很短，常常只有2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)核苷酸如一條染色體TCTGAGAGAGACGC

另一染色體TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就構(gòu)成了多態(tài)性。共二百五十四頁(yè)遺傳(yíchuán)圖譜的構(gòu)建方法

理論(lǐlùn)基礎(chǔ):連鎖與交換基本方法:兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法和三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法共二百五十四頁(yè)植物遺傳(yíchuán)圖譜的構(gòu)建

選擇研究材料（親本）構(gòu)建分離群體遺傳標(biāo)記(biāojì)檢測(cè)標(biāo)記間的連鎖分析共二百五十四頁(yè)選擇(xuǎnzé)親本

要求親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳差異大但又不能相差太大以導(dǎo)致引起子代不育。對(duì)備選材料進(jìn)行多態(tài)(差異)性檢測(cè)，綜合(zōnghé)測(cè)定結(jié)果，選擇有一定量多態(tài)性的一對(duì)或幾對(duì)材料作為遺傳作圖親本。共二百五十四頁(yè)構(gòu)建(ɡòujiàn)作圖群體

共二百五十四頁(yè)遺傳標(biāo)記(biāojì)的染色體定位

利用遺傳學(xué)方法或其它方法將少數(shù)標(biāo)記錨定在染色體上，作為確定(quèdìng)連鎖群的參照系。常用的方法：?jiǎn)误w分析三體分析代換系分析附加系分析共二百五十四頁(yè)標(biāo)記(biāojì)間的連鎖分析利用在兩個(gè)親本間有多態(tài)性的標(biāo)記分析分離(fēnlí)群體中所有個(gè)體的基因型根據(jù)連鎖交換的情況，確定標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系和遺傳距離有計(jì)算機(jī)軟件可以應(yīng)用共二百五十四頁(yè)水稻(shuǐdào)遺傳圖1994年，水稻第一張高密度遺傳圖譜

927個(gè)位點(diǎn)，1383個(gè)標(biāo)記

1998年，1157個(gè)位點(diǎn)，2275個(gè)標(biāo)記

2000年，3267個(gè)標(biāo)記高密度的遺傳圖譜為基因組測(cè)序和遺傳研究(yánjiū)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。共二百五十四頁(yè)人類遺傳圖譜(túpǔ)的構(gòu)建

不可能根據(jù)需要選擇親本，設(shè)計(jì)雜交組合，構(gòu)建分離群體！只能檢測(cè)現(xiàn)存家庭(jiātíng)連續(xù)幾代成員的基因型家系分析法資料有限、必須借助于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法共二百五十四頁(yè)現(xiàn)有(xiànyǒu)的人類遺傳圖譜1～22號(hào)染色體

8個(gè)家系134個(gè)成員

X染色體，12個(gè)家系170個(gè)成員

5364個(gè)SSR標(biāo)記

2335個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記間的平均(píngjūn)距離599kb共二百五十四頁(yè)物理圖譜(túpǔ)的構(gòu)建

用分子生物學(xué)方法直接檢測(cè)DNA標(biāo)記在染色體上的實(shí)際位置(wèizhi)繪制成的圖譜稱為物理圖譜。有遺傳圖譜為什么還要構(gòu)建物理圖譜？

共二百五十四頁(yè)遺傳圖譜(túpǔ)的缺陷

分別率有限人類只能研究少數(shù)減數(shù)分裂(jiǎnshùfēnliè)事件，不能獲得大量子代個(gè)體測(cè)序要求每個(gè)標(biāo)記的間隔小于100kb

實(shí)際是599kb共二百五十四頁(yè)遺傳(yíchuán)圖譜的缺陷精確性不夠(bùgòu)經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為，交換是隨機(jī)發(fā)生的基因組中有些區(qū)域是重組熱點(diǎn)倒位、重復(fù)等染色體結(jié)構(gòu)變異會(huì)限制交換重組共二百五十四頁(yè)酵母遺傳圖與物理(wùlǐ)圖比較A遺傳(yíchuán)圖B物理圖共二百五十四頁(yè)物理(wùlǐ)作圖的方法1、限制(xiànzhì)酶作圖2、依靠克隆的基因組作圖3、熒光原位雜交4、序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖共二百五十四頁(yè)限制(xiànzhì)酶作圖（restrictionmapping）共二百五十四頁(yè)限制(xiànzhì)酶作圖（restrictionmapping）共二百五十四頁(yè)熒光(yíngguāng)原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）共二百五十四頁(yè)熒光(yíngguāng)原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）共二百五十四頁(yè)熒光(yíngguāng)原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）共二百五十四頁(yè)熒光(yíngguāng)原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）共二百五十四頁(yè)人類(rénlèi)基因組物理圖1987年，RFLP圖譜(túpǔ)，403個(gè)標(biāo)記，10Mb1994年，5800個(gè)標(biāo)記，0.7Mb1996年，17000多個(gè)標(biāo)記，100kb

完全適應(yīng)全基因組測(cè)序的要求共二百五十四頁(yè)遺傳圖與物理(wùlǐ)圖的整合有些標(biāo)記既是遺傳標(biāo)記，又是物理標(biāo)記

RFLP標(biāo)記SSR標(biāo)記某些基因序列借助這些(zhèxiē)標(biāo)記可以將遺傳圖和物理圖整合起來(lái)共二百五十四頁(yè)§3基因組測(cè)序共二百五十四頁(yè)大規(guī)?；蚪M測(cè)序的幾個(gè)(jǐɡè)支撐技術(shù)

Sanger雙脫氧末端(mòduān)終止法

PCR技術(shù)

DNA自動(dòng)測(cè)序儀的發(fā)展生物信息學(xué)分析軟硬件設(shè)施共二百五十四頁(yè)“雙脫氧末端終止(zhōngzhǐ)”的含義共二百五十四頁(yè)

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(liànshìfǎnyìng)）原理反應(yīng)所需物質(zhì)：DNA模板、引物、DNA聚合(jùhé)酶、dNTP、緩沖液每個(gè)循環(huán)包括：變性（90℃）、退火（54

℃）、延伸（72℃）共二百五十四頁(yè)大規(guī)模基因組測(cè)序的

兩種策略逐步(zhúbù)克隆法（ClonebyClone）全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)共二百五十四頁(yè)………ATGCCGTAGGCCTAGCTAGGCCTAGCTCGGA……………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA……基因組DNABAC文庫(kù)(wénkù)根據(jù)物理圖譜正確(zhèngquè)定位的BAC或contig用于霰彈法測(cè)序的候選克隆用于霰彈法測(cè)序的亞克隆測(cè)序并組裝完整的基因組序列逐步克隆法（ClonebyClone）

全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)基因組DNA

霰彈法克隆測(cè)序并進(jìn)行全基因組序列組裝完整的基因組序列共二百五十四頁(yè)

兩種大規(guī)?；蚪M測(cè)序策略(cèlüè)的比較

項(xiàng)目

策略全基因組霰彈法逐步克隆法

遺傳背景不需要需要（需構(gòu)建精確的物理圖譜）速度快慢費(fèi)用低高計(jì)算機(jī)性能高（以全基因組為單位進(jìn)行拼接）低（以BAC為單位進(jìn)行拼接）適用范圍工作框架圖精細(xì)圖代表測(cè)序物種果蠅、水稻人、線蟲(chóng)共二百五十四頁(yè)BACbyBACWholeGenomeShotgun…thesequencingofthehumangenomeislikelytobetheonlylargesequencingprojectcarriedtocompletionbythemethodsdescribedinthisissue.MaynardV.Olson,Themaps:Clonebyclonebyclone,Nature409,816-818(2001)共二百五十四頁(yè)“WorkingDraft”(90%;4X)FinishedGenome(99.99%;8X)Gap1Gap2Chromosome工作(gōngzuò)草稿（框架圖）與完成圖共二百五十四頁(yè)BACbyBAC

共二百五十四頁(yè)ThesequenceofthehumangenomeC.Venteretal.Science16Feb.291:1304–1351,2001共二百五十四頁(yè)人類基因組計(jì)劃研究(yánjiū)的主要成果和進(jìn)展表現(xiàn)在這“四張圖”上

遺傳圖譜

又稱為連鎖(liánsuǒ)圖譜（linkagemap），指基因或DNA標(biāo)志在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離物理圖譜

以定位的DNA標(biāo)記序列如STS作為路標(biāo)，以DNA實(shí)際長(zhǎng)度即bp、kb、Mb為圖距的基因組圖譜。轉(zhuǎn)錄圖譜

利用EST（expressedsequencetags

表達(dá)序列標(biāo)簽）作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜序列圖譜

通過(guò)基因組測(cè)序得到的，以A、T、G、C為標(biāo)記單位的基因組DNA序列

共二百五十四頁(yè)逐步(zhúbù)克隆法（ClonebyClone)物理圖譜(túpǔ)的構(gòu)建大片段克隆的篩選霰彈法測(cè)序與“工作框架圖”的構(gòu)建序列的全組裝與“完成圖”構(gòu)建共二百五十四頁(yè)物理圖譜(túpǔ)的制作

共二百五十四頁(yè)物理圖譜的制作——序列(xùliè)標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）作圖

物理圖譜是以特異的DNA序列為標(biāo)志(biāozhì)所展示的染色體圖。標(biāo)志(biāozhì)之間的距離或圖距以物理距離如堿基對(duì)（basepair；bp，Kb,Mb)表示。最精細(xì)的物理圖是核苷酸順序圖，最粗略的物理圖是染色體組型圖。

STS圖譜是最基本和最為有用的染色體物理圖譜之一，STS（SequenceTaggedSite)本身是隨機(jī)地從人類基因組上選擇出來(lái)的長(zhǎng)度在200～300bp左右的特異性短序列（每個(gè)STS在基因組中是唯一的，STS圖譜就是以STS為路標(biāo)（平均每100Kb一個(gè)），將DNA克隆片段有序地定位到基因組上。STS的來(lái)源隨機(jī)基因組序列表達(dá)基因序列，如EST遺傳標(biāo)記序列，如微衛(wèi)星標(biāo)記有關(guān)STS的信息可在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GDB中找到http://gdbwww.gdb.org共二百五十四頁(yè)物理圖譜構(gòu)建的步驟確定各STS序列及其在基因組中的位置大插入片段基因組文庫(kù)的構(gòu)建（BAC文庫(kù)）

以特定STS為標(biāo)記(biāojì)篩選并定位克隆含有STS的克隆在基因組中排序基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（GDB）中至少含有24568個(gè)STS路標(biāo)(lùbiāo)信息

共二百五十四頁(yè)關(guān)于文庫(kù)作為(zuòwéi)載體的基本要求

能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制具有多克隆位點(diǎn)，可插入外源

DNA片段有合適(héshì)的篩選標(biāo)記，如抗藥性大小合適，易于分離純化拷貝數(shù)多

文庫(kù)的概念

含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體載體：能攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具，常用的載體有質(zhì)粒載體、噬菌體載體、細(xì)菌人工染色體等宿主：能容納外源DNA片段的生物體，常用的有大腸桿菌、酵母等共二百五十四頁(yè)BAC文庫(kù)(wénkù)的構(gòu)建NotI、SacI脈沖場(chǎng)凝膠電泳得200Kb左右(zuǒyòu)的大片段DNA

純化后與載體連接

電轉(zhuǎn)化，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞插有外源DNA片段的BAC載體在含有氯霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)每一個(gè)菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆共二百五十四頁(yè)BAC克隆(kèlónɡ)的篩選“STS-PCR反應(yīng)(fǎnyìng)池”方案篩選種子克隆特定的STS標(biāo)記

相互間具有重疊片段的BAC克隆根據(jù)STS信息組裝成contig，并定位于基因組上Contig每一個(gè)菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆共二百五十四頁(yè)共二百五十四頁(yè)Regionalmapping共二百五十四頁(yè)Regionalmapping共二百五十四頁(yè)Minimaltilingpathselectedforsequencing.Regionalmapping共二百五十四頁(yè)BeijingMap共二百五十四頁(yè)共二百五十四頁(yè)共48個(gè)每組8個(gè)每8個(gè)96孔板組成(zǔchénɡ)1個(gè)superpool，384個(gè)96孔板組成48個(gè)superpools

48superpools共二百五十四頁(yè)

Columnpools

Rowpools

123456789101112第八(dìbā)板第二(dìèr)板Platepools第一板

platepools，rowpools，columnpools的構(gòu)成

共二百五十四頁(yè)“STS-PCR反應(yīng)(fǎnyìng)池”方案（PoolingProtocol）

1234567891011

12超級(jí)(chāojí)池（8個(gè)96孔板，共768個(gè)克隆）板池（96個(gè)克?。┬谐兀?2個(gè)克?。┝谐兀?個(gè)克?。┐蟠鬁p少篩選的工作量，降低成本，所得篩選結(jié)果準(zhǔn)確可靠

28

VS

768共二百五十四頁(yè)sheetofsuperpools,platepools,rowpools,columnpools

共二百五十四頁(yè)

一

BACScreening前48個(gè)樣品(yàngpǐn)為引物OGG1.51對(duì)superpool(sp)的篩選結(jié)果后48個(gè)樣品為引物OGG1.52對(duì)superpool(sp)的篩選結(jié)果

共二百五十四頁(yè)引物OGG1.52對(duì)應(yīng)sp#27,34,45的plate,row,columnpools的篩選(shāixuǎn)結(jié)果共二百五十四頁(yè)BACclone確定

(+為陽(yáng)性(yángxìng)克隆)

共二百五十四頁(yè)引物OGG1.52的Colony-PCR

共二百五十四頁(yè)延伸克隆的篩選

STS的密度尚未達(dá)到繪制高精度物理圖譜的要求，且在基因組中的分布不均勻，造成(zàochénɡ)很多區(qū)域沒(méi)有陽(yáng)性克隆覆蓋,形成空洞。因此需用指紋圖譜（FPC法）或末端序列（WalkingbyEndSequence)步移等手段對(duì)種子克隆進(jìn)行延伸，形成連續(xù)克隆群。利用延伸方法篩選得到的克隆稱為延伸克隆。

Contig1Contig2重疊(chóngdié)序列重疊序列延伸引物篩選到的延伸克隆共二百五十四頁(yè)>20kb~300bpMolecularweightmarkerevery5thlaneBACclones在96深孔板中培養(yǎng)(péiyǎng)-HindIII完全酶切-1%瓊脂糖凝膠電泳

指紋圖譜法

（WalkingbyFingerprintingdatabase）

挑取靠近空洞的種子克隆，酶切構(gòu)建其指紋圖譜，在FPC數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，搜索含有此克隆的重疊克隆群信息(xìnxī)，從中確定覆蓋空洞區(qū)域的克隆，達(dá)到延伸目的。共二百五十四頁(yè)HindIII完全(wánquán)酶切HindIII完全(wánquán)酶切FPC數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)CloneACloneBCloneCCAB共二百五十四頁(yè)contig搭建(dājiàn)中克隆的錯(cuò)位

共二百五十四頁(yè)末端序列步行法（WalkingbyEndSequence）

挑取靠近空洞的種子克隆進(jìn)行末端測(cè)序，然后在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確定專一性的序列片段作為新的STS路標(biāo)。最后設(shè)計(jì)新路標(biāo)的PCR引物，按照STS—PCR“反應(yīng)池”方案篩選(shāixuǎn)新的克隆，達(dá)到延伸的目的?？寺?50A18序列輸入endsequencedatabase的查詢(cháxún)結(jié)果共二百五十四頁(yè)四、CloneIdentification

1、STS-PCR

2、BACendsequencing

3、Fingerprinting

4、FISH

共二百五十四頁(yè)CK2CK1CK2CK113f06267l16481o07250a15204c23340j13對(duì)15個(gè)克隆進(jìn)行HindIII酶切后電泳(diànyǒnɡ)結(jié)果

共二百五十四頁(yè)共二百五十四頁(yè)“工作(gōngzuò)框架圖”繪制根據(jù)序列與STSdatabase進(jìn)行blastn比較結(jié)果，將克隆定位末端序的比較，判定(pàndìng)延伸在contig外的一端序列。并可及時(shí)進(jìn)行walking，篩選新的克隆

共二百五十四頁(yè)霰彈(xiàndàn)法測(cè)序組裝與Finishing共二百五十四頁(yè)工作(gōngzuò)流程圖

共二百五十四頁(yè)ShotgunSequencingI:RANDOMPHASEBacClone:100-200kbShearedDNA:1.0-2.0kbSequencingTemplates:RandomReads共二百五十四頁(yè)ShotgunSequencingII:ASSEMBLYConsensusSequenceGap

LowBaseQualitySingleStrandedRegionMis-Assembly(Inverted)共二百五十四頁(yè)ConsensusSequenceGap

LowBaseQualitySingleStrandedRegionMis-Assembly(Inverted)ShotgunSequencingIII:FINISHING共二百五十四頁(yè)ConsensusSequenceGap

SingleStrandedRegionMis-Assembly(Inverted)ShotgunSequencingIII:FINISHING共二百五十四頁(yè)ConsensusSequenceGap

Mis-Assembly(Inverted)ShotgunSequencingIII:FINISHING共二百五十四頁(yè)ConsensusMis-Assembly(Inverted)ShotgunSequencingIII:FINISHING共二百五十四頁(yè)ShotgunSequencingIII:FINISHINGHighAccuracySequence:<1error/10,000bases共二百五十四頁(yè)Consed軟件顯示(xiǎnshì)序列組裝結(jié)果界面

1、Filling“intraclonegaps”共二百五十四頁(yè)BAC-----453F3’sfinishing>>Sp6<<T7?First4primers1234Allthecontigswalkedhundreds’bpstowardthegaps.453F3’s2600reads12contigsOverlappingBAC-454F24’s200reads+>>Sp6<<T71324abcSecond3primers

1200bp’sAT-rich,(CATATATA)nrepeat.Finally,filledbyusingETsequencingKit.

1240bp’sGC-rich,GC-contentis69.03%;theBAC’sis39.98%.WeuseddGTPKitfillingit.>>Sp6<<T7Completedsequence共二百五十四頁(yè)

SequencedcloneBACselectedbyend-sequence113L10324K11173F11101A4167P17586C2116K5572B22544N5R-155E142006P232306M15R-149E1560K?Gapfillingbyendsequences2、Filling“interclonegaps”共二百五十四頁(yè)

TheactualandpredictedfingerprintofR-260J13digestedwithHindIII

Lane1:marker,Lane2:R-260J13digestedwithHindIII,3:thepredicted

共二百五十四頁(yè)克隆211B19組裝(zǔzhuānɡ)后的序列的錯(cuò)誤率為零

共二百五十四頁(yè)WholeGenomeShotgun

共二百五十四頁(yè)Thisbacteriumhasacirculargenomestructurewith2,689,445basepairs,thesecondlargestoneofthermophilesdecodedcompletelytodate.CircularrepresentationofthegenomeofT.tengcongensis

共二百五十四頁(yè)Whatisunderheavenisforall.

SunYat-sen,thefatherofmodernChina

天下為公(tiānxiàwéigōng)

/riceDDBJ/EMBL/GenBank:AAAA01000000共二百五十四頁(yè)國(guó)際一流(yīliú)測(cè)序生產(chǎn)線7萬(wàn)克隆，3000萬(wàn)堿基/天高產(chǎn)出、低成本：$/bp

￥/bp美分/bp分/bp基因組學(xué)：數(shù)據(jù)導(dǎo)向(dǎoxiànɡ)的大科學(xué)有數(shù)據(jù)才是硬道理世上無(wú)難事只要肯登攀共二百五十四頁(yè)Contigs:127,550

(N50=6,688bp)Scaffolds:102,444(N50=11,764bp)Quality:546bpatQ20共二百五十四頁(yè)DeNovoSequencingtheGenomeinBIGHuSongnianBeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciencesNextGenerationSequencing(NGS)Technology共二百五十四頁(yè)Secondgenerationsequencers4541Solexa3SOLiD5DenovosequencingRNA-seq,Re-sequencingChIP-seq，Meth-seqMetagenomicsDenovosequencingRNA-seqRe-sequencingChIP-seqRNA-seq“known”GenomeNovelgenome(s)Bothtypes共二百五十四頁(yè)1x4545xSOLiD4.02x5500xl3xSOLEXA2xHiseq20003x3730xl1xsequenom1000CPUcores800TBStorage數(shù)據(jù)中心完善的試驗(yàn)與測(cè)序體系和流程強(qiáng)有力的計(jì)算、存儲(chǔ)及數(shù)據(jù)庫(kù)支持體系成熟的生物信息數(shù)據(jù)處理和分析流程2025/1/5共二百五十四頁(yè)基因(jīyīn)測(cè)序技術(shù)與基因(jīyīn)組測(cè)序第一代測(cè)序技術(shù)化學(xué)降解法雙脫氧鏈終止法熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)（雙脫氧鏈終止法）雜交(zájiāo)測(cè)序技術(shù)第二代DNA測(cè)序技術(shù)454測(cè)序技術(shù)Solexa測(cè)序技術(shù)SOLiD測(cè)序技術(shù)第三代DNA測(cè)序技術(shù)單分子測(cè)序共二百五十四頁(yè)基因組測(cè)序策略(cèlüè)有了高密度的基因組圖譜，就可以開(kāi)始全基因組測(cè)序了測(cè)序的技術(shù)飛速發(fā)展，現(xiàn)在可以全自動(dòng)化測(cè)序的策略(cèlüè)有兩個(gè)：鳥(niǎo)槍法克隆重疊群法共二百五十四頁(yè)鳥(niǎo)槍法（shotgunsequencing）共二百五十四頁(yè)鳥(niǎo)槍法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：不需要高密度的圖譜速度快、簡(jiǎn)單、成本低缺點(diǎn)：拼接組裝困難，尤其在重復(fù)(chóngfù)序列多的區(qū)域主要用于重復(fù)序列少、相對(duì)簡(jiǎn)單的原核生物基因組共二百五十四頁(yè)克隆(kèlónɡ)重疊群法（clonecontig）

將基因組DNA切割長(zhǎng)度為0.1Mb－1Mb的大片段，克隆到Y(jié)AC或BAC載體(zàitǐ)上然后再進(jìn)行亞克隆，分別測(cè)定單個(gè)亞克隆的序列再裝配、連接成連續(xù)的DNA分子。這是一種自上而下（uptodown）的測(cè)序策略

clone-by-clonemethod共二百五十四頁(yè)基因組測(cè)序

快速有效的DNA測(cè)序方法于20世紀(jì)70年代中期建立。兩種不同的序方法幾乎同時(shí)發(fā)表：

鏈終止法（chainterminationmethod）(Sangeretal,1977)：?jiǎn)捂淒NA分子的序列由互補(bǔ)(hùbǔ)的多核苷酸的酶促合成來(lái)決定，互補(bǔ)(hùbǔ)鏈在特定的核苷酸位置終止。

化學(xué)降解法（chemicaldegradationmethod）(MaxamandGilbert,1977)：雙鏈DNA分子用化學(xué)物質(zhì)處理后，在特定核苷酸位置被切開(kāi)，從而確定DNA分子的序列。今年6月30日，基因組所新一代測(cè)序技術(shù)——SOLiDTM系統(tǒng)基因分析儀投入使用。共二百五十四頁(yè)鏈終止法測(cè)序(thechainterminationmethod)

基本原理:

通過(guò)合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)(yīɡè)核苷酸的DNA分子，從而來(lái)讀取待測(cè)DNA分子的順序。共二百五十四頁(yè)技術(shù)(jìshù)路線與要求制備(zhìbèi)單鏈模板

↓將單鏈模板與一小段引物退火

↓加入DNA多聚酶

4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳

↓根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

A克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNAC噬?？寺NADPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高酶活性B無(wú)5’→3′外切酶活性C無(wú)3′→5′外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子,不是羥基共二百五十四頁(yè)共二百五十四頁(yè)共二百五十四頁(yè)化學(xué)降解法測(cè)序基本原理:

在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)集團(tuán),再用化合物處理,使DNA分子(fēnzǐ)在被修飾的位置降解.共二百五十四頁(yè)技術(shù)(jìshù)路線:

將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)(yīɡè)核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序共二百五十四頁(yè)化學(xué)法測(cè)序?qū)嵗?shílì)哌啶共二百五十四頁(yè)第二代測(cè)序技術(shù)(jìshù)454測(cè)序技術(shù)(jìshù)Solexa測(cè)序技術(shù)SOLiDTM測(cè)序技術(shù)共二百五十四頁(yè)454測(cè)序技術(shù)(jìshù)

1文庫(kù)準(zhǔn)備將基因組DNA打碎成300-800bp長(zhǎng)的片段(若是snRNA或PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)入下一步),在單鏈DNA的3′2端和5′2端分別連上不同的接頭。2連接帶有接頭的單鏈DNA被固定在DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶一個(gè)單鏈DNA片段。隨后擴(kuò)增試劑將磁珠乳化(rǔhuà),形成油包水的混合物,這樣就形成了許多只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。3擴(kuò)增每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增(乳液PCR,emulsionPCR),從而排除了其它序列的競(jìng)爭(zhēng)。整個(gè)DNA片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)片段而言,擴(kuò)增產(chǎn)生幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。乳液PCR終止后,擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。4測(cè)序攜帶DNA的捕獲磁珠被放入PTP板中進(jìn)行測(cè)序。PTP孔的直徑(29μm)只能容納一個(gè)磁珠(20μm)。放置在4個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的4種堿基,依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板,每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì),就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶和熒光素酶的作用下,釋放出光信號(hào),并實(shí)時(shí)地被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì),就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào);由此一一對(duì)應(yīng),就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列[27]。共二百五十四頁(yè)Solexa測(cè)序技術(shù)(jìshù)

1GenomeAnalyzer技術(shù)的基本原理是將基因組DNA打碎成約100-200個(gè)堿基的小片段,在片段的兩個(gè)末端加上接頭(adapter)。2將DNA片段變成單鏈后通過(guò)接頭與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)而使一端被固定在芯片上。另外一端隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ),也被固定住,形成橋狀結(jié)構(gòu)。3通過(guò)30輪擴(kuò)增反應(yīng),每個(gè)單分子被擴(kuò)增大約1000倍,成為單克隆的DNA簇,隨后將DNA簇線性化。在下一步合成反應(yīng)中,加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。在DNA合成時(shí),每一個(gè)核苷酸加到引物末端時(shí)都會(huì)釋放出焦磷酸鹽,激發(fā)生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。4用激光掃描反應(yīng)板表面,在讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類后,將這些熒光基團(tuán)化學(xué)切割,恢復(fù)3′端黏性,隨后添加(tiānjiā)第二個(gè)核苷酸。如此重復(fù),直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣,統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果,就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列[28]。共二百五十四頁(yè)Solexa測(cè)序?qū)嶒?yàn)(shíyàn)流程圖

共二百五十四頁(yè)--SOLiDTM系統(tǒng)(xìtǒng)基因分析儀

該技術(shù)以用四色熒光標(biāo)記寡核苷酸進(jìn)行連續(xù)的連接反應(yīng)為基礎(chǔ)，能夠?qū)慰截悢U(kuò)增DNA片段進(jìn)行大規(guī)模高通量并行測(cè)序。這項(xiàng)技術(shù)使用末端(mòduān)配對(duì)分析和雙堿基編碼，在對(duì)復(fù)雜基因組進(jìn)行測(cè)序研究時(shí)其準(zhǔn)確度將大大高于其它新一代測(cè)序技術(shù)。共二百五十四頁(yè)SOLiDTM測(cè)序技術(shù)(jìshù)1文庫(kù)準(zhǔn)備SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測(cè)序模板:片段文庫(kù)(fragmentlibrary)或配對(duì)末端文庫(kù)(mate2pairedlibrary)。片段文庫(kù)就是將基因組DNA打斷,兩頭加上接頭,制成文庫(kù)。該文庫(kù)適用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RNA定量、miRNA研究、重測(cè)序、3′,5′2RACE、甲基化分析及ChIP測(cè)序等。配對(duì)末端文庫(kù)是將基因組DNA打斷后,與中間接頭連接,環(huán)化,然后用EcoP15酶切,使中間接頭兩端各有27bp的堿基,最后加上兩端的接頭,形成文庫(kù)。2擴(kuò)增SOLiD用的是與454技術(shù)類似的乳液PCR對(duì)要測(cè)序的片段進(jìn)行擴(kuò)增。在微反應(yīng)器中加入測(cè)序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物,進(jìn)行乳液PCR(emulsionPCR)。PCR反應(yīng)結(jié)束后,磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同一DNA模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。3微珠與玻片連接乳液PCR完成之后,變性模板,富集帶有延伸模板的微珠,微珠上的模板經(jīng)過(guò)3′修飾,可以與玻片共價(jià)結(jié)合。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠,在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。含有DNA模板的磁珠共價(jià)結(jié)合在SOLiD玻片表面,SOLiD測(cè)序反應(yīng)就在SOLiD玻片表面進(jìn)行。每個(gè)磁珠經(jīng)SOLiD測(cè)序后得到一條序列。4連接測(cè)序SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。探針的5′端用4種顏色的熒光標(biāo)記,探針3′端第1、2位堿基是ATCG4種堿基中的任何兩種堿基組成的堿基對(duì),共16種堿基對(duì),因此每種顏色對(duì)應(yīng)著4種堿基對(duì)。3-5位是隨機(jī)的3個(gè)堿基。6-8位是可以和任何堿基配對(duì)的特殊堿基。單向SOLiD測(cè)序包括5輪測(cè)序反應(yīng),每輪測(cè)序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng),得到原始顏色序列。SOLiD序列分析軟件根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把堿基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列,然后與SOLiD原始顏色序列進(jìn)行比較。由于雙堿基編碼規(guī)則中一種顏色對(duì)應(yīng)4種堿基對(duì),前面堿基對(duì)的第二個(gè)堿基是后面堿基對(duì)的第一個(gè)堿基,所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)引起連鎖(liánsuǒ)的解碼錯(cuò)誤,改變錯(cuò)誤顏色編碼之后的所有堿基。SOLiD序列分析軟件可以對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行自動(dòng)校正,最后“解碼”成原始序列。因?yàn)镾OLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù),在測(cè)序過(guò)程中對(duì)每個(gè)堿基判讀兩遍,從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤,提供內(nèi)在的校對(duì)功能,得到的原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%,而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%,是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的[29,30]。超高通量是共二百五十四頁(yè)

基因組所引進(jìn)SOLiDTM系統(tǒng)，將大大推進(jìn)基因組測(cè)序和分析的能力。該系統(tǒng)每輪運(yùn)行可以產(chǎn)生超過(guò)30億堿基（相當(dāng)于一個(gè)人類基因組全序列）的可定位數(shù)據(jù)?？蓪?duì)多種菌株進(jìn)行極高覆蓋度的測(cè)序分析；能夠?qū)Πㄌ厥饧膊』蛘咚幬锉硇偷仍趦?nèi)的完整基因進(jìn)行精確的序列分析；也能用于高通量的基因表達(dá)研究，而其成本和時(shí)間消耗大大低于傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)。SOLiDTM系統(tǒng)還能夠?yàn)槿旧|(zhì)免疫共沉淀研究提供一種全新的高特異性和高準(zhǔn)確度的方法；其高敏感度使SOLiDTM系統(tǒng)既能對(duì)常規(guī)基因芯片上可檢測(cè)的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，又可以對(duì)以前必須通過(guò)實(shí)時(shí)PCR的方法才能看到的基因進(jìn)行檢測(cè)。

基因組所引進(jìn)SOLiDTM系統(tǒng)，對(duì)于同中科院其它兄弟院所進(jìn)行廣泛的交流與合作提供更加有力的支撐(zhīchēng)作用，特別是在開(kāi)展靶基因重測(cè)序研究、基因表達(dá)分析、MicroRNA(非編碼小分子RNA)的發(fā)現(xiàn)、染色質(zhì)免疫共沉淀研究以及其它物種全基因組序列測(cè)定等相關(guān)研究方面給予強(qiáng)大的支持。共二百五十四頁(yè)共二百五十四頁(yè)第二代測(cè)序技術(shù)(jìshù)之比較共二百五十四頁(yè)第三代測(cè)序技術(shù)(jìshù)“采用了高密度DNA（玻璃板）納米芯片技術(shù)，在芯片上嵌入DNA納米球，然后用非連續(xù)、非連鎖聯(lián)合探針錨定連接（cPAL）技術(shù)來(lái)讀取序列，兩項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用減少了試劑的消耗和成像的時(shí)間”。該系統(tǒng)整合了文庫(kù)、陣列、測(cè)序分析、儀器以及軟件上的技術(shù)進(jìn)步。與目前流行的第二代測(cè)序技術(shù)相比，新方法能在消耗更少試劑的前提下獲得更多的數(shù)據(jù)。每臺(tái)機(jī)器能獲得1000Gb的數(shù)據(jù)，比目前的測(cè)序技術(shù)提高了一個(gè)(yīɡè)數(shù)量級(jí)，也降低了整體的成本。共二百五十四頁(yè)第三代測(cè)序方法(fāngfǎ)1核酸外切(wàiqiē)酶測(cè)序法2合成測(cè)序法3納米孔測(cè)序法4透射電鏡測(cè)序技術(shù)共二百五十四頁(yè)核酸(hésuān)外切酶測(cè)序法共二百五十四頁(yè)合成(héchéng)測(cè)序法真實(shí)單分子測(cè)序法（tSMS)能量(néngliàng)共振轉(zhuǎn)移測(cè)序法（FRET）SMRT測(cè)序法（SMRT）共二百五十四頁(yè)合成(héchéng)測(cè)序法-tSMS共二百五十四頁(yè)合成(héchéng)測(cè)序法-FRET能量共振(gòngzhèn)轉(zhuǎn)移共二百五十四頁(yè)合成(héchéng)測(cè)序法-SMRT共二百五十四頁(yè)納米(nàmǐ)孔測(cè)序技術(shù)雜交輔助(fǔzhù)的納米孔測(cè)序法(HANS)寡聚物輔助的納米孔測(cè)序法共二百五十四頁(yè)透射電鏡測(cè)序技術(shù)(jìshù)

以單鏈線性DNA為模板，以三種重元素標(biāo)記(biāojì)，一種不標(biāo)記(biāojì)的脫氧核苷酸為原料，合成其互補(bǔ)鏈，經(jīng)透射電鏡（TEM）檢測(cè)，則可見(jiàn)重元素標(biāo)記，其互補(bǔ)鏈則可由點(diǎn)的大小和強(qiáng)度被分辨出來(lái)共二百五十四頁(yè)第二三代測(cè)序技術(shù)(jìshù)比較共二百五十四頁(yè)測(cè)序平臺(tái)SOLiDSolexaGA454DNAFragment2-5ug2-5ug2-5ugPair-end2-5ug2-5ugMate-pair5-100ug5-100ug5-100ugRNA轉(zhuǎn)錄組10-20ug10ug10ugSmallRNA10-15ug10-15ugMicroRNA40-50ug40-50ug建庫(kù)時(shí)間1-2周1-2周1-2天上機(jī)時(shí)間單向6天雙向12天單向5天雙向10天10小時(shí)共二百五十四頁(yè)SequencingGlossaryReads.Acollectionofclonesthatover-samplethetargetgenome.Pair-endreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofasequencing-libraryclone.Mate-pairreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofamate-pairlibraryclonewhichinsertsizeisusually>1kb.Insertsize.Thesizeoftheclone-insertfromwhichaclone-endpairistaken.Contig.

Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencereads.Scaffold.

Theresultofconnectingnon-overlappingcontigsbyusingpair-endreads.N50size.Asappliedtocontigsorscaffolds,thatsizeabovewhich50%oftheassembledsequencecanbefound.共二百五十四頁(yè)GenomeassemblystrategyContigassemblyScafffoldingInternalgapclosing/2010/11/4/R41共二百五十四頁(yè)RecentwholegenomesequencingprojectsTable.BasicinformationofRrecentlysequencedgenomes.OrganismGenomesizestrategyCoverageContigScafffolds#N50MaxTotal#N50MaxTotalHuman3.0GbSolexa45x2.76M1.5Kb18.8Kb2.18GbNRNRNRNRApple742.3MbSangr+4544.4x+12.5x122,14616,171NR603.9Mb1,629102KbNR598.3Castor320MbSanger4.59x54,00021.1kb190kb324Mb25,828496.5kb4.7Mb350.6MbGrapevine500MbSangr+4547x+4.2x58,61118.2Kb238kb531Mb2,0931.33Mb7.8Mb421MbPanda2.4GbSolexa74x200,60436,728434,6352.25Gb81,4961.22Mb6.05Mb2.30GbStraberry220Mb454+solexa+solid24.5x+6.4x+6.4x16,48728,072215,349202Mb3,2631.44Mb4.1Mb214MbCacoo430Mb454+sanger+solexa16.7x+44x25,91219.8kb190Kb291.44,792473.8Kb3415Kb326.9MbTomato900Mb454+sanger+solexa+solid31x+3.6x+82x+140x110,87255.7kbNR763Mb3,7614.45MbNR782MbPotato840Mb454+solexa+solid11x+106x+0.2x111,18731KbNR683Mb66,301387KbNR727Mb共二百五十四頁(yè)共二百五十四頁(yè)

FlowchartoftheWGSdenovoassemblyGenomicDNADNAfragmentation,constructfragmentedlibrariesGeneratesequencingreadsusing454technologySequencingerrorcorrectionOutputcontigsFillinintra-scaffoldgapsandgetthefinalscaffoldsGenomicDNADNAfragmentation,constructpaired-endlibrarieswithvariantinsertsizesGeneratesequencingreadsusingIlluminaGAtechnologySequencingpre-processOutputcontigsandminiscaffoldsSolexapart454partHybridassemblyandscffolding共二百五十四頁(yè)

454readsprocessRawreadsKmerevaluationQ20,removeadaptor,trimSequencingpre-processNewblerassemblyAssembledreadsUnassembledreadsUnigenecoverageKmerevaluationSolexamappingNr/NtblastContigstatusAssemblyHybridscaffolding共二百五十四頁(yè)

SolexareadsprocessRawreadsKmerevaluationSequencingpre-processSoapassemblyAssembledreadsUnassembledreadsUnigenecoverageKmerevaluationSolexamappingNr/NtblastContigstatusAssemblyMappingto454contigHybridscaffoldingCov/Comp共二百五十四頁(yè)longreadsassemblycontigsshortreadsA+C–B–scaffoldingA+B–C–scaffoldsFixgapHybridassembly共二百五十四頁(yè)ESTUnigeneScafAScafCScafBScafDNewScafABCDESTbasedAssemblyinshortreadsofNGS:ConstructeBIGerScaffording共二百五十四頁(yè)Rawsequencingreadspre-processingISignificanceandpurposeSequencinglibraryqualitycontrolSequencingbiasanalysisInheritedprosperitiesoncertainsecondgenerationsequencerGenomesequencingblackholeeffectTranscriptomesamplingandquantificationbiasReadyformappingReadyfordenovoassembly共二百五十四頁(yè)Rawsequencingreadspre-processingIISequencingreadsnumbersDuplicatesdetection,