生物化學(xué)實驗課件-3蛋白質(zhì)的鹽析分離和凝膠排阻層析脫鹽

實驗三

蛋白質(zhì)的鹽析分離和

凝膠排阻層析脫鹽鹽析法粗分離蛋白質(zhì)凝膠排阻層析法將鹽和蛋白質(zhì)分開紫外分光光度法和醋酸鋇法分別測定蛋白質(zhì)和鹽離子濃度，鑒定脫鹽是否成功實驗?zāi)康募耙笳莆整}析分級分離蛋白質(zhì)的原理掌握凝膠排阻層析的原理熟悉鹽析、凝膠排阻層析及紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的操作在蛋白質(zhì)分子表面的親水基團附近，水分子形成水化層，有利于蛋白質(zhì)溶解在蛋白質(zhì)分子表面的疏水基團附近，水分子極化排列，避免蛋白質(zhì)聚集蛋白質(zhì)分子表面的可解離基團在適當(dāng)?shù)膒H條件下，與周圍溶液中電荷相反的鹽離子間形成穩(wěn)定的雙電層，使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間相互作用增強

蛋白質(zhì)溶解的原理蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度由蛋白質(zhì)周圍親水基團與水形成水化層的程度,以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定鹽析沉淀定義

蛋白質(zhì)在高離子強度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象原理1.中性鹽比蛋白質(zhì)具有更強的親水性，因此將與蛋白質(zhì)爭奪水分子，使蛋白質(zhì)脫去水化層2.高濃度鹽離子使蛋白質(zhì)表面所帶的電荷被中和，雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱，蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭到破壞而沉淀析出鹽析的影響因素

蛋白質(zhì)的種類：

分子量越大，沉淀所需鹽的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）蛋白質(zhì)分子不對稱性越大，越容易沉淀

溫度：

高離子強度溶液中，升高溫度有利于蛋白質(zhì)的失水沉淀低離子強度溶液或純水中，蛋白質(zhì)的溶解度在一定溫度范圍內(nèi)一般隨溫度升高而增大

pH值：

在接近蛋白質(zhì)等電點的溶液中進行鹽析有利于蛋白質(zhì)的沉淀。需要注意在高鹽溶液中蛋白質(zhì)的等電點會發(fā)生偏移鹽析的用鹽要求鹽析作用強足夠大的溶解度，適于低溫操作生物惰性，不會使蛋白質(zhì)變性密度小且來源豐富

硫酸銨價廉，易于提純，鹽析效果好溶解度高（4M）沉淀的高濃度蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定(2-3M)

阻止蛋白水解

蛋白質(zhì)的層析分離定義：根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計的蛋白質(zhì)物理分離方法，又名色譜法。原理：

各種不同的層析方法都包括一個固定相和一個流動相。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合溶液或氣體(流動相)通過裝有重填材料的管或柱(固定相)時，由于混合物中各組份在物理化學(xué)性質(zhì)(如吸引力、溶解度、分子的形狀與大小、分子的電荷性與親和力)等方面的差異使各組分在兩相間進行反復(fù)多次的分配而得以分開固定相：常用交聯(lián)葡聚糖凝膠，如Sephadex系列，有不同凝膠孔徑可供選擇流動相：蛋白質(zhì)混合溶液及沖洗緩沖液凝膠排阻層析(分子篩層析、分子排阻層析、凝膠過濾層析)實驗原理：按照分子量大小依次分離混合蛋白質(zhì)

每個凝膠珠都有一定孔徑大小。含有不同大小的蛋白質(zhì)混合樣品流入凝膠柱后，大分子量物質(zhì)不能進入凝膠珠內(nèi)部，而沿凝膠珠之間的間隙穿行，迅速流出；小分子量物質(zhì)進入凝膠珠內(nèi)部反復(fù)穿行，緩慢流出。固定相流動相實驗簡述通過鹽析法使雞蛋卵清蛋白和卵球蛋白分離；通過鹽溶法使沉淀析出的卵球蛋白再次溶解制備葡聚糖凝膠SephadexG-25凝膠排阻層析柱通過凝膠排阻層析分離卵球蛋白和鹽離子檢測層析后收集的各管樣品中的鹽離子（醋酸鋇法）檢測各管樣品中的蛋白質(zhì)含量（UV法）分析結(jié)果：鹽析分離蛋白及凝膠排阻層析脫鹽是否成功？實驗一卵球蛋白的鹽析分離0.7ml卵清+0.7ml飽和硫酸銨溶液（每組2個EP管）混合均勻（避免產(chǎn)生氣泡）靜置3-5分鐘，蛋白質(zhì)析出3000rpm，離心3分鐘用移液槍去除上清（含卵清蛋白）1ml水充分溶解卵球蛋白沉淀3000rpm,離心3分鐘將兩管上清合并，即為樣品加50%硫酸銨溶液1.5ml洗滌3000rpm，離心3分鐘用移液槍去除上清實驗二凝膠柱的制備和蛋白脫鹽垂直固定層析柱，并安裝乳膠管、止水夾向?qū)游鲋屑尤?/3體積的水，以平衡、排出基質(zhì)和乳膠管中的氣泡；若層析柱流水不暢，應(yīng)反復(fù)正反沖洗柱基質(zhì)??！液面降至基質(zhì)上2cm后，用止水夾關(guān)閉水流將葡聚糖凝膠混懸液緩慢勻速倒入層析柱中，使凝膠自然沉降，柱高25-30cm左右，注意裝填均勻，無氣泡和裂紋打開止水夾，加入1-1.5倍體積的水以平衡層析柱，直至液面到凝膠床表面后關(guān)閉止水夾用滴管均勻上樣，打開止水夾，在下端用EP管接住流出液體待蛋白樣品完全進入層析柱后，加入水繼續(xù)洗脫蛋白，注意加水速度恒定，以保持洗脫壓強一致。EP管標(biāo)記順序，1.5ml/管收集洗脫液。待鹽離子濃度降為零后，停止洗脫。凝膠柱裝填和使用過程中，保持凝膠面上有水，否則氣泡進入將影響實驗結(jié)果樣品溶液的濃度大一些好，但粘度不宜大，加樣體積通常為凝膠柱床體積的1%-10%洗脫速度要恒定實驗完畢后，將凝膠全部回收處理，以備下次實驗使用，嚴(yán)禁將凝膠丟棄或倒入水池中凝膠柱的制備和蛋白脫鹽注意事項實驗三脫鹽后離子測定及蛋白濃度測定測定分步收集的樣品液（1.5ml樣品+1.5mlH2O）的A280吸光度，繪制蛋白脫鹽洗脫曲線2.蛋白濃度測定

醋酸鋇與溶液中的硫酸根離子可以形成白色的沉淀，同時不能同蛋白質(zhì)形成沉淀。1.硫酸根離子濃度測定（決定是否停止洗脫）

從每管洗脫液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸鋇溶液，觀察沉淀實驗中設(shè)陰性對照(雙蒸水)和陽性對