生物化學實驗原理與方法

生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法第一章：生物化學物質的制備第二章：離心技術第三章：層析技術第四章：電泳技術第五章：基因克隆技術第六章：PCR技術第七章：生物芯片技術2025/1/3生物化學實驗原理與方法第一章:生化物質的制備

生化物質通常是指動物、植物和微生物進行新陳代謝時產生的蛋白質（包括酶）和核酸等有機化合物。這些大分子物質在生物體內具有各種生理活性，這些活性的產生與其結構有著密切關系，因此，分離此類物質不能用一般的化學分離方法，而是采用比較特殊的方法。這些方法與一般的化學分離方法相比，有下列幾個特點：1、生物材料組成非常復雜。其中包括數(shù)百種甚至數(shù)千種化合物，并且在分離過程中，這些化合物仍在發(fā)生代謝變化，如蛋白質和核酸的水解。2、有些化合物的含量極微，如激素等。3、許多具有生物活性的物質一旦離開活體，很易變變性破壞，因此常選用比較溫和的條件進行制備。4、生化分離制備幾乎都在溶液中進行，影響因素很多，實驗方法經(jīng)驗性較強。2025/1/3生物化學實驗原理與方法第一節(jié)：生物材料的選擇

選擇生物材料的原則：有效成分含量多，穩(wěn)定性好；來源豐富，保持新鮮；提取方法簡單；有綜合利用價值等。生物材料一般可以分為兩大類：天然生物材料和人工生物材料。天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量較高的生物個體、器官或組織。人工生物材料又分為三種：1、新品種材料2、組織培養(yǎng)材料3、生物產品與生物制品材料2025/1/3生物化學實驗原理與方法第二節(jié)：細胞及組織的破碎細胞及組織破碎的方法多種多樣，根據(jù)實驗目的和材料的不同可以采用不同的細胞破碎方法，細胞破碎方法大致可以分為四類：機械破碎：研磨法；組織搗碎法；超聲波法；壓榨法；凍融法溶脹和自溶溶脹：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，引起細胞膜發(fā)生脹破的現(xiàn)象。自溶：細胞結構在本身所具有的各種水解酶如蛋白酶和酯酶等作用，發(fā)生溶解的現(xiàn)象?；瘜W處理用脂溶性的溶劑（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性劑（SDS）處理細胞時，可以把細胞壁、細胞膜的結構部分溶解，進而使細胞釋放出各種酶類物質，并導致整個細胞破碎。生物酶降解

生物酶有降解細菌細胞壁的功能，在用此法處理細胞時，先是細胞壁降解，隨之而來的是因滲透壓差引起的細胞膜破裂，最后導致細胞完全破碎。2025/1/3生物化學實驗原理與方法第三節(jié)：生物分子的提取提取是在分離純化前期，將樣品研磨，把被破碎的細胞置于一定的溶劑（提取液）中，使某一類分子目的物釋放到提取液中的過程。提取液應具備的條件：對有效成分溶解度大，破壞作用小；對雜質溶解度小或不溶解；來源廣泛、價格低廉、操作安全等。生物分子可以分為生物大分子和生物小分子。生物小分子的結構由較強的共價鍵決定；生物大分子中除共價鍵外，還含有較弱的共價鍵和次級鍵，故需溫和的條件才能保證生物大分子的活性不被破壞。因此，這兩類生物分子的提取液成分和操作條件差別很大。1、生物小分子的提取2、生物大分子的提取

蛋白質和酶的提取核酸的提取2025/1/3生物化學實驗原理與方法溶劑提取法原理:利用溶劑的溶解作用把所需物質從細胞中轉移出來影響溶劑提取效率的因素（影響溶解度的的因素）1、溶劑的性質：（根據(jù)相似相溶原理）2、離子強度：離子強度是影響物質溶解度的主要因素，但離子強度對不同物質溶解度的影響不同，如高離子強度下DNA-核蛋白溶解度增加，而低離子強度下RNA-核蛋白溶解度增加；絕大多數(shù)蛋白質和酶，在稀鹽溶液中溶解度增加（鹽溶）。3、PH值：溶劑的PH值影響溶質分子的解離狀態(tài)，離子狀態(tài)的物質，不能是陽離子還是陰離子都易溶于水，而非離子狀態(tài)的物質易溶于有機溶劑。4、溫度：溫度的升高可以增加物質的溶解度。5、去垢劑：去垢劑是一類既有親水基又有疏水基的物質，可以分為陰離子、陽離子和中性去垢劑等，如SDS，Tween20，TritonX-100。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法第四節(jié)：生物大分子的濃縮1、沉淀法:在提取液中加入適量的中性鹽或有機溶劑，使有效的成分變?yōu)槌恋恚?jīng)過離心或過濾收集的沉淀物，加少量緩沖液溶解后，在經(jīng)離心出去不溶物，獲得的上清液通過透析或凝膠過濾脫鹽。鹽析法；有機溶劑沉淀法；等電點沉淀法；非離子多聚體沉淀法；生成鹽復合物沉淀法；熱變性沉淀法；酸堿變性沉淀法等。2、吸附法：將干葡聚糖凝膠加入提取液中，由于凝膠吸水，提取液的體積可縮小三倍左右。3、超過濾法：把提取液裝入過濾裝置，在空氣或氮氣的壓力下，使小分子物質通過半透膜，大分子物質留在膜內。4、透析濃縮法5、減壓蒸餾濃縮法：將提取液裝入減壓蒸餾裝置中，在減壓真空狀態(tài)下進行蒸餾。6、冰凍干燥法2025/1/3生物化學實驗原理與方法一、硫酸氨鹽析法原理：根基蛋白質在稀鹽溶液中溶解度會隨著鹽濃度的增高而上升（鹽溶），但當鹽濃度增高到一定數(shù)值時，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質析出，。鹽析的發(fā)生在于鹽濃度增高到一定數(shù)值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子之間相互聚集并從溶液中析出。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法影響蛋白質鹽析的因素１、蛋白質濃度對鹽析的影響：蛋白質濃度過大，鹽析時發(fā)生共沉現(xiàn)象，分離效果不好；蛋白質濃度太稀，耗鹽量過大，蛋白質回收率也低。一般為2.5%-3.0%的蛋白質濃度較適中。２、離子強度和離子類型對鹽析的影響：離子強度越大，蛋白質的溶解度越低，越容易產生鹽析現(xiàn)象；離子半徑小而價數(shù)高的離子在鹽析方面影響較強，離子半徑大而價數(shù)低的離子對鹽析影響弱。３、ＰＨ對鹽析的影響：蛋白質所帶凈電荷越多，溶解度越大；在凈電荷為零時，溶解度最低。一般將ＰＨ值調到蛋白質等電點附近，這樣有利于鹽析。４、溫度對鹽析的影響：在低離子強度或水中在一定范圍內蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增加；但在高鹽溶液中，溫度的升高有時反而下降。一般情況下在０~４℃操作。2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、有機溶劑沉淀法原理：有機溶劑對許多溶于水的小分子生化物質以及核酸、多糖、蛋白質等生物大分子都能發(fā)生沉淀作用。有機溶劑的沉淀作用主要是降低溶液的介電常數(shù)從而增強分子之間的相互作用，使其溶解度降低。對于具有表面水層的生物大分子來說，有機溶劑可破壞溶質分子表面的水膜，使這些大分子脫水而相互聚集析出。不同溶質要求不同濃度的有機溶劑，因此可用有機溶劑進行分步沉淀。優(yōu)點：有機溶劑沉淀法分辨能力比鹽析法高，沉淀不用脫鹽，過濾比較容易。缺點：對某些具有生物活性的大分子，容易引起變性失活，操作常在低溫下進行；分離效果差，共沉作用大；離子強度及離子種類對其也有影響。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法三、透析濃縮法原理：天然或人工半透膜只允許小分子通過而阻礙大分子通過。當膜的兩側存在小分子濃度梯度差時，小分子就從高濃度一側向低濃度一側擴散，直至達到平衡，如果能不斷去除擴散出來的小分子，從而達到分離純化的目的。影響透析的因素1、半透膜的通透性：半透膜的通透性取決于膜孔徑的大小，在能阻礙大分子擴散的前提下，孔徑越大，透析速度越快。2、透析外液的更換3、溫度：溫度越高，透析速度越快。4、壓力：用跨膜的壓力梯度可加速大分子的分離速度。5、溶劑2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法四、等電點沉淀法原理：利用兩性電解質在等電點處溶解度最小的性質。不同的兩性電解質其等電點不同，其在電中性時溶解度不相同。因而等電點沉淀法可用于某些兩性電解質的分離如氨基酸、蛋白質、核苷酸等，為了增加沉淀效果，往往在等電點時再加上其他沉淀因素，所以幻燈片2等電點沉淀法一般不單獨使用，常和鹽析法、有機溶劑沉淀法一起使用，以提高其沉淀能力。2025/1/3生物化學實驗原理與方法第二章：離心技術

第一節(jié)、離心技術的原理當物體圍繞一中心軸做圓周運動時，運動物體就受到離心力的作用。旋轉速度越高，運動物體所受到的離心力越大。如果裝有懸浮液或高分子溶液的容器進行高速水平旋轉，強大的離心力作用于溶劑中的懸浮顆?；蚋叻肿?，會使其沿著離心力的方向運動而逐漸背離中心軸。在相同轉速條件下，容器中不同大小的懸浮顆粒或高分子溶質會以不同的速率沉降。經(jīng)過一定時間的離心操作，就有可能實現(xiàn)不同懸浮顆?；蚋叻肿尤苜|的有效分離。2025/1/3生物化學實驗原理與方法第二節(jié)、影響離心沉降速率的因素

球型顆粒在自然沉降過程中：

摩擦力F1=6πηrpdr/dt

浮力F2=(ρp-ρm

)VgV=4/3πrP2球形顆粒的自然沉降速率：dr/dt=2rp2(ρp-ρm)g/9η在離心力作用下，非球形顆粒的沉降速率:

dr/dt=2rp2(ρp-ρm)w2

r/9η(f/f0)影響沉降速率的主要因素：顆粒半徑rp的大小；顆粒形狀；顆粒與懸浮的密度差(ρp-ρm

)；一定溫度下懸浮介質的黏度系數(shù)η；離心加速度w2r。在確定的條件下，沉降速率主要取決于離心機的轉速。2025/1/3生物化學實驗原理與方法第三節(jié)、沉降系數(shù)

dr/dt=2rp2(ρp-ρm)w2

r/9η(f/f0）

s=

2rp2(ρp-ρm)/9η(f/f0）

dr/dt＝sw2

r

S為沉降系數(shù)，表示單位離心力場下的沉降速率即通過單位離心力場所需的時間，因此單位為秒。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法沉降系數(shù)的作用：1、描述顆粒的大小2、預計沉降時間對已知S值的物質，可預計在離心管中的沉降所需時間。3、測定物質的分子量根據(jù)Svedberg公式可計算出分子量。

M=RTS20,w/D20,w(1-Vρ)

R--氣體常數(shù)，等于1.987卡/度.摩爾

T—熱力學溫度

S20,w--標準狀況下粒子的沉降系數(shù)

D20,w理想狀態(tài)時粒子的擴散系數(shù)

V微分比容，等于溶質粒子密度的倒數(shù)ρ--溶劑密度2025/1/3生物化學實驗原理與方法第四節(jié)、離心設備離心機一般由離心機主機，轉頭，離心管三部分組成。根據(jù)轉速的高低把離心機分為三種：低速離心機（轉速在2000—6000r/min，最大RCF可達6000g）；高速離心機（轉速在18000—25000r/min，最大RCFd達60000g）；超速離心機（轉速在40000—100000r/min，最大RCF可達803000g）。根據(jù)離心機的性能可分為：分析型，制備型和分析制備型。轉頭可分為：角度轉頭，垂直轉頭，水平轉頭。離心管及其管帽是轉頭重要的附件，制造離心管的材料主要有特種玻璃，塑料和不銹鋼。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法第五節(jié)、制備型超速離心法制備型超速離心法可以用來分離細胞，亞細胞結構或高分子。根據(jù)分離的原理的不同，制備超速離心法又可分為差速離心法和密度梯度離心法。一、差速離心法

原理及操作步驟：差速離心法又叫分級分離法。裝有不均一的粒子的離心管在離心機中高速旋轉時，大小，密度不同的粒子將以各自的沉降速率移向離心管底部。如果設計一定的轉速和時間，沉降速率最大的首先沉淀在離心管底部，沉降速率中等及較小的組分繼續(xù)留在上清液中。將上清液轉移到另一離心管中，提高轉速并掌握一定的時間，就可獲得沉降速率中等的組分，如此反復操作，就可實現(xiàn)對不同組分的分離。

優(yōu)點：操作簡單。

缺點：效率低，費時，所得組分不單一。2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、密度梯度離心法

原理：離心操作在密度梯度介質中進行的離心方法。根據(jù)操作方法的不同，密度梯度離心法又可分為速率區(qū)帶離心和等密度梯度離心。

1、速率區(qū)帶離心：

速率區(qū)帶離心法依據(jù)樣品中各組分沉降速率的差別而使其互相分離。在離心管中灌制好預制的一種正密度梯度介質液，在其表面鋪上一層樣品溶液，離心期間，樣品中各組分會按照它們各自的速率沉降，被分離成一系列的樣品組分區(qū)帶，故稱速率區(qū)帶離心。預制密度梯度介質的作用有二個，一是支撐樣品，二是防止離心過程中產生的對流對已形成區(qū)帶的破壞作用。但是樣品液的密度一定要大于密度梯度介質的最大密度，否則就不能使樣品各組分得到有效分離。離心過程中，各組分的移動是相互獨立的。因此，S值相差很小的組分也能得到很好的分離，這是差速離心法做不到的。但速率區(qū)帶離心不適于大量制備實驗。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2、等密度梯度離心依據(jù)粒子本身的密度差異而進行分離。如果離心管中介質的密度梯度范圍包括待分離樣品中所有組分的密度，離心過程中各組分將逐步移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶，這種分離方法稱為等密度梯度離心。在等密度梯度離心中，組分的分離完全取決于組分之間的密度差。離心時間的延長或轉速提高不會破壞已經(jīng)形成的樣品區(qū)帶，也不會發(fā)生共沉現(xiàn)象。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法三、速率區(qū)帶離心與等密度梯度離心的區(qū)別

1、依據(jù)的原理不同速率區(qū)帶離心依據(jù)粒子的沉降速率被分離；等密度梯度離心依據(jù)粒子本身的密度差異被分離。2、介質的梯度范圍不同，速率區(qū)帶離心介質的密度小于樣品中各種粒子的密度；等密度梯度離心介質密度大于樣品各種粒子的密度。3、時間效應不同速率區(qū)帶離心不能長時間離心；等密度梯度離心長時間離心將各種粒子停留在等密度位置形成區(qū)帶。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法第三章、層析技術

第一節(jié)、層析技術的原理原理：層析技術是層析分離技術是一種物理的分離方法，利用混合物中各組份物理化學性質的差別（如吸引力，分子形狀和大小，分子的極性，分子親和力，分配系數(shù)等），使各組分以不同程度分布度在兩相中（其中一相為固定相，另一相為流動相），從而使各組分以不同速度移動而達到分離。層析分離技術在上個世紀就已在生產實踐上應用。1903年用于植物色素的分離提取，分離后的葉綠素和葉黃素等在碳酸鈣的吸附柱上從上到下排列成色譜，故也稱為“色層分離法”。1931年，有人用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構異構體，顯示了這一分離技術的高度分辨力，從此吸引了人們的廣泛關注。自1944年應用濾紙作為固定支持物的“紙層析”誕生以來，層析技術的發(fā)展越來越快。1950年以來，相繼出現(xiàn)了氣相層析，高壓液相層析，薄層層析，薄膜層析，親和層析，凝膠層析等2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法第三節(jié)、層析技術的分類分類：根據(jù)操作形式的不同，層析技術可分為紙層析，薄層層析和柱層析。

根據(jù)理化性質的不同，層析技術可分為吸附層析，分配層析，高壓液相層析，吸附分配層析，離子交換層析，排阻層析，親和層析，氣相色普層析。

層析基本操作步驟：

1，選擇適當?shù)奈絼?/p>

2，加樣

3，展開

4，檢出和鑒定2025/1/3生物化學實驗原理與方法第三節(jié)、薄層層析原理：以薄層板作為支持介質的層析。在玻璃板上涂布一層支持劑，待分離樣品點在薄層板一端，然后讓推動劑從上流過，從而使各組分得到分離的物理方法。常用的支持劑：硅膠G，硅膠GF，氧化鋁，纖維素，硅藻土，纖維素G，交聯(lián)葡聚糖凝膠等。基本操作步驟：薄層板的準備；點樣；展開；定位；定量。應用：氨基酸，多肽，蛋白質及酶，維生素，核甘酸，脂肪酸，脂類，糖類，磷脂，生物堿，酚類等物質的分離優(yōu)點：設備簡單，操作方便，快速靈敏，分析制備兼適2025/1/3生物化學實驗原理與方法第四節(jié)、聚酰胺薄層層析原理：用于層析的聚酰胺基團有兩類：錦綸66（尼龍）和錦綸6，這兩類材料中都含有大量的酰胺基團，故統(tǒng)稱為聚酰胺。聚酰胺以其－CO－或－NH－與極性化合物的－OH或＝O之間形成氫鍵，從而發(fā)生吸附作用。不同物質與聚酰胺之間形成氫鍵的能力不同。在聚酰胺薄膜上做層析分離時，流動相從薄膜表面流過，被分離物質在溶劑和薄膜之間按分配系數(shù)的大小，發(fā)生不同速率的吸附與解吸過程，從而使混合物得到有序的分離。2025/1/3生物化學實驗原理與方法影響遷移率的主要因素1、成鍵基團數(shù)目越多，吸附力越大2、成鍵基團的位置，影響氫鍵數(shù)目和強度3、芳香環(huán)，共雙鍵越多，成鍵越強4、被分離物質分子內氫鍵的形成，可以削弱它與聚酰胺之間氫鍵的形成5、溶劑的影響優(yōu)點：對極性化合物有特異的分辨能力，靈敏度高，操作方便，速度快，樣點不擴散，有熒光的物質可用紫外燈檢出，不必噴顯色劑顯色。用途：分離多種化合物，在蛋白質或肽的N末端殘基分析中是個比較理想的方法，對丹酰氨基酸的分析可達10－9～10－102025/1/3生物化學實驗原理與方法第五節(jié)、紙層析原理：依據(jù)物質在兩相中分配系數(shù)的不同進行的分離。分配系數(shù)是指一種溶質在兩種互不相容的溶劑中達到平衡時，該物質在固定相和流動相中的濃度比，K=C固/C液分配系數(shù)K與溫度，壓力，溶質和溶劑有關。在同一條件下，各種物質的分配系數(shù)不同，因此可以用紙層析進行分離。紙層析以濾紙為介質濾紙纖維和水有較強的親和力，能吸收22％左右的水，其中6－7％的水以氫鍵形式與纖維的羥基結合，在一般條件下較難脫去。而濾紙纖維與有機溶劑的親和力較弱，所以紙層析實際上是以濾紙纖維及其結合水作為固定相，以其有機溶劑作為流動相。當有機相沿濾紙經(jīng)過樣品點時，樣品點上的溶質在水相和有機相之間進行分配，一部分溶質離開原點隨著有機相移動，進入無溶質區(qū)，此時又進行重新分配，沿著有機相方向移動。溶質中各種不同組分有不同的分配系數(shù)，移動速度也不同，從而使混合物得到分離。2025/1/3生物化學實驗原理與方法影響遷移率的主要因素1、物質結構與極性2、層析溶劑3、PH值４、溫度５、展開方式紙層析的應用：既可以用來定性，也可以用來定量。1、剪洗法2、掃描法2025/1/3生物化學實驗原理與方法第六節(jié)、凝膠層析

一、原理：又稱凝膠過濾，是一種柱層析方法。層析柱中裝有水不溶凝膠顆粒，顆粒內部形成多孔的三維網(wǎng)狀結構，凝膠是高度親水的，在水溶液里吸水膨脹，當在膠床表面加上分子大小不同的樣品混合物并用洗脫液洗脫時，直徑小于網(wǎng)孔的自由通透小分子可以進入膠粒內部，需層層擴散，流過的路程比較長，最后流出；而直徑大于網(wǎng)孔直徑的大分子不能進入膠粒內部，沿著膠粒的間隙向下流出，所經(jīng)路程短，最先流出；通透性居中的分子則后于大分子而先于小分子流出，從而按從大到小的順序實現(xiàn)對大中小分子的分離。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、常用的凝膠材料：交聯(lián)葡聚糖，交聯(lián)瓊脂糖，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖，多孔玻璃，聚苯乙烯等。三、操作步驟1、凝膠的選擇和處理2、凝膠柱的制備3、加樣4、洗脫5、凝膠柱的再生和保存四、優(yōu)點：操作條件溫和，適于分離不穩(wěn)定的化合物，回收率高，分離效果好，重現(xiàn)性強，分離需時短，柱可反復使用。五、用途：廣泛用于生化物質的分離，脫鹽，制備，分子質量的測定等。2025/1/3生物化學實驗原理與方法第七節(jié)、離子交換層析一、原理：在含有可與周圍介質進行離子交換的基質上進行化合物分離的方法叫離子交換層析。離子交換層析是根據(jù)物質的酸堿性，極性，和分子的大小的差異而進行的柱層析技術。二、離子交換材料：陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。帶有酸性可電離基團的以－SO3H表示，稱為陽離子交換樹脂；帶有堿性可以電離基團以R4NOH表示，稱為陰離子交換樹脂。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法三、離子交換層析的操作步驟

1、離子交換劑的處理、再生和轉型常規(guī)處理是加適量的水懸浮除去細顆粒，然后再用酸堿浸泡，以便除去雜質和使其帶上需要的反離子；使用過的離子交換劑可采用酸、堿反復處理使其恢復原來的性質；改型是指離子交換劑由一種反離子轉到另一種反離子的過程。2、分離物質的交換3、物質的洗脫與收集2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法四、離子交換層析前要注意以下幾點：1，離子交換劑的選擇：考慮被分離物質帶有什么樣的電荷；分子的大小；物理化學性質等。2，離子交換劑的準備：除去交換劑中的雜質；交換劑的溶脹；除去交換劑中細小的微粒；改型。3，緩沖液的選擇：對陰離子交換劑應當用陽離子緩沖液；對于陰離子交換劑應用陰離子交換劑；緩沖液離子的PK值要在所用的PH值附近；緩沖系統(tǒng)的選擇不影響分離物質的活性，溶解度，不干擾分析；選擇的PH值決定于被分離物質的等電點，穩(wěn)定性和溶解度。五、應用：用來分離極性較強，電離度大的混合物。2025/1/3生物化學實驗原理與方法第八節(jié)、親和層析一、原理：利用某些生物分子之間專一可逆結合特性的分離方法二、基本操作：尋找能被分離分子（配體）識別和可逆結合的專一性物質－－配基；把配基共價結合到層析介質（載體）上，即把配基固定化；把載體－－配基復合物罐裝在層析柱內做成親和柱；上樣親和，洗滌雜質，洗脫收集親和分子（配體），親和柱再生。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法三、親和層析介質—載體的選擇要求：1，非特異性吸附作用要低，與其它大分子的作用很微弱。2，必須具有很好的液體流動性3，在較寬的PH，離子強度和變性劑濃度范圍內具有化學和物理穩(wěn)定性4，必須具有合適的豐富的化學基團，配基可以共價地和它結合，并在連接的條件下是穩(wěn)定的5，必須具有非常有效的多孔性常用的三種介質：瓊脂糖（常用），聚丙烯酰胺凝膠和受控多孔玻璃球。2025/1/3生物化學實驗原理與方法四、配基的選擇配基是發(fā)生親和反應的功能部位，也是載體和親和分子之間的橋梁。配基本身必須具備兩個基團：一個能與載體共價結合；一個能與被親和分子結合可以作為配基使用的物質有：酶底物的類似物；效應物；酶的輔助因子。選擇好的配基有兩個標準：一是在蛋白質和配基之間必須有強的親和力；二是必須具有適當?shù)幕瘜W基團，這種基團不參與配基與大分子特異結合，但可以用來連接配基和支持物，而且這種連接不影響配基和大分子結合的親和力。配基和支持物的結合方法：載體結合法；物理吸附法；交換法；包埋法。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法五、應用1、酶2、抗原與抗體3、結合蛋白和輸送蛋白4、受體蛋白5、細胞及病毒

2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法第九節(jié)、氣相色普一、原理：氣相色普與一般柱層析相似，是在柱內進行的。混合樣品隨固定流速的載氣進入層析柱。此種樣品必須是氣態(tài)的，如果樣品原是液態(tài)或固態(tài)，要使之進入層析柱的剎那間變成氣態(tài)，層析柱內裝有稱為擔體的顆粒狀惰性支持物，其表面為一類具有高沸點的有機化合物均勻地包裹著，使擔體表面形成以一層很薄的液膜，當樣品氣體進入層析柱遇到這種固定液時就能溶解在固定液中，它遇熱又能揮發(fā)到載氣里，并隨載氣的定向流動而向前推進，遇到新的固定相又被吸收，如此交替吸收和揮發(fā)，使樣品蒸汽所經(jīng)過的每一點都進行著固定相和流動相之間的分配平衡。由于樣品中組分在固定相和流動相的分配系數(shù)不同，經(jīng)過一段時間后原來均勻混合的樣品彼此分離了，被分離的組分按先后次序被載氣帶入鑒定器，在那里把進入的樣品組分濃度轉換成電壓，經(jīng)放大后在自動記錄儀上記錄下來。從給樣到每一組分出現(xiàn)的層析峰s上的時間稱為保留時間，不同化合物在一定條件下有其特定的保留時間，還根據(jù)峰面積來計算各種化合物的含量，這就是氣相色普法中氣液層析的簡單原理2025/1/3生物化學實驗原理與方法氣相色普儀的組成1載氣：常用的氣體有氫氣，氮氣，氦氣，CO2,氬氣等，2層析柱：儀器的重要組成部分，3支持物（擔體）：作用是支持固定液，這種物質無吸附性能，是惰性的，即不與固定相或要分離的組分起任何反應，高溫下也不變性。4固定液：沒有揮發(fā)性，對要分離的組分有足夠的溶解能力。5樣品：一般采用ug到mg量范圍，并盡可能以濃縮方式送入柱內。6鑒定器：是測定流出氣體組分的裝置，要求能迅速地反應組分的變化，有很好的穩(wěn)定性，有足夠的靈敏度，重復性好，而且結構簡單，與組分無作用，有較寬的操作溫度。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、氣相色普的特點：1氣體粘度小，氣相與液相間的質量傳遞速率高，容易達到平衡。2檢查氣體中的組分比檢定液體的組分容易3氣液色普法中固定相液體的選擇范圍很廣，操作溫度范圍也很寬。4由于有靈敏的檢測器，樣品用量很少。2025/1/3生物化學實驗原理與方法三、應用1、分析蛋白質和氨基酸2、分析核酸3、分析糖類物質4、分析脂肪酸5、分析農藥2025/1/3生物化學實驗原理與方法第十節(jié)、高效液相色普一、原理：高效液相色普儀一般由溶劑槽，高壓泵，分析柱，進樣器，檢測器，部分收集器，記錄儀，數(shù)據(jù)處理機等單元組成。根據(jù)柱中擔體種類的不同，其分離原理有以下幾類：1，液－液分配層析：利用溶質在流動相中的分配系數(shù)的差別而達到分離的目的。2，液－固吸附層析：利用溶質被固體吸附劑吸附能力的差別而達到分離的目的。3，離子交換層析：通過溶質和樹脂擔體的交換作用，利用不同溶質離子交換能力的差別而達到分離目的。4，凝膠滲透層析：按溶質分子量大小而分離。2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、高效液相色譜儀的組成1、進樣系統(tǒng)2、輸液系統(tǒng)3、分離系統(tǒng)4、檢測系統(tǒng)5、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)三、應用1、定性和定量分析2、測定酶的活性3、測定蛋白質的分子量4、分離核酸和核蛋白四、優(yōu)點：高效，高靈敏度，高速，定量準確和應用范圍廣。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法第四章、電泳電泳的概念：帶電物質在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。電泳現(xiàn)象早在十九世紀初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學家Re?ss進行了世界上第一次電泳實驗）。但電泳技術的廣泛應用，則是在1937年用濾紙作為支持介質成功地進行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術發(fā)展很快，各種類型的電泳技術相繼誕生，在生物化學、醫(yī)學、免疫學等領域得到了廣泛應用。2025/1/3生物化學實驗原理與方法電泳的分類原則上按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質的電泳，待分離物質在支持介質上分離成若干區(qū)帶。支持介質的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質不同以及技術上的差異，又可分為不同的類型。2025/1/3生物化學實驗原理與方法按支持介質種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：以醋酸纖維素為支持介質，主要在醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。2025/1/3生物化學實驗原理與方法③淀粉凝膠電泳：以淀粉為支持介質，多用于同工酶分析。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調性差，可重復性較差，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：以瓊脂糖為支持介質，一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質2025/1/3生物化學實驗原理與方法另外根據(jù)支持介質形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：板電泳和柱電泳。據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量電泳、免疫電泳。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法電泳槽及電泳儀水平板式電泳槽垂直板式電泳槽2025/1/3生物化學實驗原理與方法電泳條帶2025/1/3生物化學實驗原理與方法第一節(jié)、基本原理

電泳是在電場的作用下而產生的物質運動，不同的物質在一定的電場強度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動速度不同進而達到分離目的。2025/1/3生物化學實驗原理與方法若將帶凈電荷Q的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為：F引=EQ（1）在溶液中,運動粒子與溶液之間存在阻力F阻F阻=6πrηV(2)當F引=F阻時EQ=6πrηV(3)

V=EQ/6πrη(4)由上式可以看出,粒子的移動速度(泳動速度V)與電場強度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大的阻力，即粒子的泳動速度與粒子形狀有關。2025/1/3生物化學實驗原理與方法V=EQ/6πrη(4)在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時間內它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術進行分離、分析和鑒定的基本原理。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法影響遷移率的因素

V=EQ/6πrη(4)由（4）可知，帶電粒子的泳動速度受電場強度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場里泳動速度不同，為了便于比較，常用遷移率m（或稱泳動率，指帶電粒子在單位電場強度下的泳動速度）代替泳動速度表示粒子的泳動情況。m=V/E=Q/6πrη（5）

由上式可以看出，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量，粒子大小及溶液粘度有關而與電場強度無關。2025/1/3生物化學實驗原理與方法由于蛋白質、氨基酸以及核酸等的電離度α隨溶液pH變化而不同，所以實際上常使用有效遷移率。有效遷移率U為遷移率m和當時條件下電離度α的乘積。

U=ma

（6）

將（6）式代入（5）式得：m=Q/6πrη（5）

U=

Qa/6πrη

（7）由（7）式可以看出，凡能影響溶液粘度η的因素如溫度，影響分子帶電量Q及解離度α的因素如pH的改變，都會對有效遷移率，產生影響。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法

以上討論的是在溶液中進行的自由界面電泳的情況，在用支持介質的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電滲（是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動）的影響。電泳時應避免用高電滲物質作支持介質。最后要考慮選用離子強度適宜的溶液。離子強度影響粒子的電動勢，溶液的離子強度越高，由于溶液中的離子會分擔大部分電流，則粒子的電動電勢越小，泳動速度越慢，反之越快?？傊?，電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH、電滲及離子強度多種因素的影響。2025/1/3生物化學實驗原理與方法第二節(jié)、常用電泳支持介質一、聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是目前應用最廣泛的電泳支持介質,其機械強度高,彈性好,透明,化學性質穩(wěn)定,屬于非離子型化合物,沒有吸附和電滲現(xiàn)象。１、凝膠的組成

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑(過硫酸氨，APS）的作用下合成的。凝膠的物理性質用凝膠濃度（T）和交聯(lián)度（C）兩個參數(shù)來描述：T%=（Acr+Bis/V）*100；C%=（Bis/Acr+Bis）*100。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法２、影響凝膠孔徑的因素凝膠孔徑大小主要受濃度的影響，濃度越大，孔徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷；濃度太小，凝膠稀軟，不易操作。通常把7.5%的凝膠稱為標準膠。當在標準凝膠濃度上分離效果不理想時，可以調整凝膠濃度。當凝膠濃度確定之后，交聯(lián)度為5%時，凝膠具有最小的孔徑。如果用聚丙烯酰胺凝膠分離大分子核酸，通常用大孔徑凝膠。為了提高機械強度，最好加入0.5%瓊脂糖或在3%的凝膠中加20%蔗糖。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法３、聚丙烯酰胺凝膠的合成①、過硫酸氨—TEMED化學催化聚合系統(tǒng)在此系統(tǒng)中，四甲基乙二胺（TEMED）稱為加速劑，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使過硫酸氨（APS引發(fā)劑）形成自由基。這些自由基的產生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。②、核黃素—TEMED光聚合催化系統(tǒng)在此系統(tǒng)中，核黃素經(jīng)紫外線光解形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置。2025/1/3生物化學實驗原理與方法4、聚丙烯酰胺凝膠的性能制作良好的聚丙烯酰胺凝膠與其他凝膠相比有如下優(yōu)點：1、聚丙烯酰胺凝膠是人工合成三維網(wǎng)狀結構的凝膠，具有分子篩作用，其篩孔的大小可人為控制和調節(jié)，并且制備重復性好。2、聚丙烯酰胺凝膠是碳-碳結構，沒有或很少帶有極性基團，因而吸附少，電荷作用小，不易和樣品相互作用，化學性質比較穩(wěn)定。3、凝膠無色透明，適宜用光密度掃描記錄結果，且需要樣量較少。4、用途廣泛，具有彈性，便于操作，易于保存。由于其具有上述特點，特別適合做區(qū)帶電泳的支持物，用于酶帶的分離以及進行分子量的測定。2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、瓊脂糖凝膠瓊脂糖是一種直連多糖，在水浴中加熱溶解，冷凝后靠糖鏈間的氫鍵作用形成凝膠調整瓊脂糖濃度，可獲得不同孔徑的凝膠，用作電泳支持介質。由于瓊脂糖具有親水性及不含帶電荷的基團，因此很少引起敏感的生化物質的變性和吸附，是分離生物高分子尤其是核酸的優(yōu)良電泳介質。用瓊脂糖配置電泳凝膠，只需將瓊脂糖在緩沖液中加熱溶化，在將凝膠倒入電泳槽中即可。聚丙烯酰胺凝膠濃度在2.4%~20%，分離范圍1.0×106~3.3×102Da；瓊脂糖凝膠濃度在0.1%~2.5%，5×108~5×104Ｄａ2025/1/3生物化學實驗原理與方法三、瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的區(qū)別１、分離范圍不同瓊脂糖凝膠電泳分離分子量比較大的物質，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝膠分離分子量較小的物質，如蛋白質，氨基酸等。２、凝膠配置程序不同瓊脂糖凝膠在緩沖液中加熱融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝膠在配置時還要加多種成分，并且對聚合溫度也有一定的要求，否則會影響凝膠孔徑的大小。３、凝膠的厚度不同瓊脂糖凝膠最薄只能達到３ｍｍ；聚丙烯酰胺凝膠可以制成０.２ｍｍ，分辨率高。４、成本不同瓊脂糖價格便宜；聚丙烯酰胺凝膠價格較高５、安全性不同瓊脂糖沒有毒性；聚丙烯酰胺凝膠有毒性2025/1/3生物化學實驗原理與方法第三節(jié)、非變性—聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳

聚丙烯酰胺凝膠分為非變性凝膠和變性凝膠兩種。所謂非變性凝膠，即在凝膠中不加變性劑，這種凝膠中，蛋白質的遷移率受它的靜電荷與分子大小兩個因素的影響。因此在非變性凝膠中進行電泳是不能測得分子量的。所謂變性凝膠，即在凝膠中加入變性劑，如尿素、SDS(十二烷基磺酸鈉)、巰基乙醇、DTT等。這些變性劑可以破壞或改變蛋白質的結構，把絕大部分蛋白質分離成組成它們的亞基。同時在蛋白質分子周圍包圍了大量負電荷。這種電荷基本上掩蓋了無變性劑存在時正常就有的任何電荷。蛋白質在這種變性凝膠中的遷移率與它們分子量的對數(shù)成直線關系。因此利用變性凝膠進行電泳可以測得蛋白質的分子量。目前應用較多的變性劑為SDS。本節(jié)介紹非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的原理：在區(qū)帶電泳的基礎上，以不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質，利用凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子的不連續(xù)性、PH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶，然后進行分離。三、根據(jù)緩沖液的PH值的高低，可分為堿性系統(tǒng)、酸性系統(tǒng)和中性系統(tǒng)2025/1/3生物化學實驗原理與方法堿性系統(tǒng)堿性系統(tǒng)的組成1、分離膠，由T=7.5%，C=2.5%的單體溶液和PH8.9的Tris-HCl緩沖液經(jīng)過硫酸氨催化聚合而成的小孔徑凝膠。被濃縮的樣品進入分離膠后，在電荷效應和分子篩效應共同作用下得到分離。2、濃縮膠，由T=3%，C=2%的單體溶液和PH6.7的Tris-HCl緩沖液組成，經(jīng)催化聚合而成的大孔徑凝膠。它使樣品在進入分離膠之前被濃縮成薄層，從而提高了電泳分離的分辨率3、樣品膠，由T=3%，C=20%單體溶液、待分離樣品溶液以及PH6.7的Tris-HCl緩沖液。主要起抗對流的作用使樣品不被電極緩沖液稀釋。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法2025/1/3生物化學實驗原理與方法堿性系統(tǒng)的三種物理效應1、濃縮效應

是由于柱膠中凝膠層的不連續(xù)性、緩沖離子成分的不連續(xù)性、PH的不連續(xù)性及電泳開始后產生的電位梯度不連續(xù)性綜合作用形成的。2、電荷效應

蛋白質樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質區(qū)，但由于每種蛋白質分子所帶有效電荷不同，因而泳動率也不同，因此各種蛋白質就按泳動率快慢順序排列成一個一個圓盤區(qū)帶。在進入分離膠時，電荷效應仍起作用。3、分子篩效應當被濃縮的蛋白質樣品從濃縮膠進入分離膠時，pH值和凝膠孔徑突然改變，選擇分離膠的pH值8.9接近甘氨酸的Pka值（9.7～9.8），這樣慢離子的解離度增大，因而它的有效泳動率也增加。此時慢離子的有效泳動率超過了所有蛋白質的有效泳動率。這樣，高電勢梯度不存在了，各種蛋白質僅會由于其分子量或構型的不同，在一個均一的電勢梯度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠時所受阻滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動率的不同而被分開。2025/1/3生物化學實驗原理與方法四、操作步驟1、凝膠的制備2、樣品的準備3、加樣4、電泳5、剝膠6、固定7、染色8、脫色9、結果記錄2025/1/3生物化學實驗原理與方法1、凝膠的制備配制凝膠前，應把玻璃管裝好。裝玻管的方式很多：在凝膠架的孔洞內，加少許40%蔗糖溶液，然后把洗凈干燥的玻璃管套上乳膠管，插入架的孔洞內，使玻璃管、乳膠管與孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶蓋封口，或者用附有玻璃短柱的乳膠管封口；底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在試管架上；也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培養(yǎng)皿中，然后用1%瓊脂趁熱倒在培養(yǎng)皿中，冷卻后，玻璃管口即被瓊脂凝膠封住。配制凝膠時，先將所需的貯備液自冰箱中取出，放至室溫下預溫。聚丙烯酰胺凝膠通常只制備二種膠。先制備分離膠，再在分離膠上面制備濃縮膠，樣品膠一般不制作，這是因為①有些樣品會抑制膠聚合；②光照可引起某些蛋白質變性；③多了一道手續(xù)，延長制膠時間。2025/1/3生物化學實驗原理與方法①、分離膠的制備：按比例混合貯存液，(先不與過硫酸銨混合)，放在真空干燥器中抽氣，排除溶液中空氣。抽氣后在貯存液中加入過硫酸銨混勻，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入膠液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好標記，注膠到相同的高度。務必勿使氣泡出現(xiàn)。為了使凝膠表面平整，在凝膠表面再慢慢地加入一層水，約3～5mm高度，消除凝膠的彎月面。加水要小心，切勿沖亂界面。加水的另一作用是隔絕空氣中氧與膠液接觸。以防影響頂部膠層的聚合。注射器中殘留的膠液要立即清洗掉，以防膠液在針頭與注射器中聚合，而使其損壞。水層放好后，靜置30分鐘，使凝膠進行化學聚合反應。聚合最適溫度為25℃。當水剛加入膠面時，水與凝膠形成一界面，后界面慢慢消失，當凝膠聚合時，水與凝膠之間又出現(xiàn)界面。界面的再出現(xiàn)表明凝膠已經(jīng)聚合，再靜置20～30分鐘，聚合便完全。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法②、濃縮膠的制備：分離膠聚合好后，用注射器小心吸去水層，用濾紙條吸去殘余的水。按比例混合濃縮膠液(也預先抽氣，抽氣時不要與核黃素混合，使用時再混勻)，先用這種凝膠液漂洗一下分離膠頂，除去漂洗液后，再用注射器加濃縮膠溶液1cm左右，各管加的高度應一致，并在上面加水層壓平膠面。放在兩只20W以上功率的日光燈下，約離燈管10～15cm處，光下聚合60分鐘左右，當濃縮膠由淺黃色變?yōu)椴煌该鞯娜榘咨?，即聚合完成，取出水層，吸干后用電極緩沖液洗滌，準備加樣。濃縮膠應臨用前制備。2025/1/3生物化學實驗原理與方法2、樣品的準備聚丙烯酰胺盤狀電泳可用于分離各種蛋白質、核酸等樣品。例如血清、唾液、細胞膜蛋白，動植物及微生物的各種蛋白提取液，昆蟲的體液，各種酶制品，色素蛋白復合體以及核糖核酸等。初學者可用現(xiàn)成的蛋白質樣品如血清練習操作。盤狀電泳所需要的樣品是很少的。一個標準凝膠管按體積，需要5～100μl的樣品(約0.1～2mm高)；按含量需要5～100μg。實際上就是用0.1%濃度的樣品5～100μl。由于樣品組分的不同，用量可有一定的幅度。對于只含有少數(shù)組分的樣品，通常用10～20μg，對于含有多種組分的樣品，可用到200μg。即每一凝膠的樣品容納量不僅指所加的樣品總量，更重要的是指樣品混合物組分的量。所加樣品液量的精確性將影響重復性，誤差要不大于±5%。近來，樣品膠一般已改用樣品液中加入5%～20%的蔗糖或10%甘油代替，因為樣品膠的作用主要是抗對流，蔗糖液和甘油能起同樣的效果。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法

如果樣品離子強度太高，會引起分界面模糊不清，嚴重時完全不能進行電泳。因離子強度太高時降低了蛋白質的電動電位，同時電導過高，在樣品部分幾乎沒有電勢梯度，以至樣品的泳動速度近于零，不能泳動。硫酸銨鹽析的樣品或柱層析高鹽濃度的洗脫部分，必須透析除鹽，務必使其電導低于分離膠的電導，以便形成足夠的電勢梯度，使區(qū)帶在分離之前進行濃縮變窄。如果樣品過稀，加樣體積太大時，相應地加厚濃縮膠層。玻璃管也要適當加長。通常稀樣液與濃縮膠的比不大于1∶1.2。一個生物樣品（粗抽提物），常需要事先經(jīng)過處理(高速離心，微孔濾膜過濾，柱分離等)去除沉淀，消除混濁?；蛑蝗】扇苄圆糠诌M行電泳。不然常有許多物質留在凝膠與緩沖液的界面上，阻塞凝膠，干擾分離。當樣品裝載量與樣品溶解度不相應時，也會在濃縮膠上或濃縮膠與分離膠界面上產生沉淀，并造成拖尾現(xiàn)象（隨著電泳過程，沉淀逐漸溶解，逐漸進入）。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法3、加樣加樣前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，應先讓空氣進去，再拔管子，防止凝膠拉壞。下槽中放滿緩沖液，把玻管固定在盤狀電泳槽上槽的洞中。安裝時要特別注意保證凝膠管垂直和橡膠塞孔密封不漏。管的下端懸一滴電極緩沖液。先在下槽放上電極緩沖液，再把上槽放在下槽上，避免管下有氣泡。然后加樣。加樣方法因人習慣不同而略有差異。有的把樣品與增加比重的蔗糖及指示劑先混在一起加樣；有的指示劑單獨加在玻璃管中或在上槽電極緩沖液中滴上幾滴指示劑。加樣時，有的先加好樣液，再在樣品上加幾滴緩沖液，然后在樣液上加電極槽緩沖液；有的先在上槽中加滿電極緩沖液，然后用加樣器插在緩沖液中往膠管濃縮膠上方加樣?？偟脑瓌t，先提高樣品的比重，后加樣，加樣和加電極緩沖液互不干擾。2025/1/3生物化學實驗原理與方法4、電泳

在電泳槽中注滿電極緩沖液。緩沖液應事先在冰箱中預冷，上槽電極緩沖液必須浸沒玻管和電極。連接直流穩(wěn)壓電源，緩沖液系統(tǒng)為堿性時上槽為負極，下槽為正極。緩沖系統(tǒng)為酸性時則相反。Davis標準狀態(tài)的凝膠電泳，負極在上，正極在下，電泳槽一般放在冰箱中，保持溫度在0～4℃。打開電源開關，調節(jié)電流，開始時用1～2mA/管，電泳3～5分鐘后，再逐漸升高到4mA/管。不要一開始就電流很高。電流最好不要超過5mA/管。太高的電流強度會造成產熱量大，使分離失敗。如果高溫對樣品不利，可降低電流，延長時間，或進行有效冷卻，在整個電泳過程中，一般要求電流保持穩(wěn)定。電泳時間與所用緩沖液和樣品有關，一般根據(jù)指示劑的遷移來決定，如果指示劑已遷移到凝膠柱的下口附近，或已遷移管長的3/4距離時，就可停止電泳，關閉電源，取出玻璃管。上槽電極緩沖液可連續(xù)使用幾次，但必須每次測一下PH，如PH值發(fā)生改變就不能再使用。每次電泳后，下槽中混入了催化劑及氯離子，如將下槽緩沖液用于上槽，則影響電泳。重要的電泳，電極緩沖液最好用新鮮的。2025/1/3生物化學實驗原理與方法5、剝膠

為了防止電泳后凝膠中蛋白(酶)盤狀區(qū)帶擴散，電泳完畢必須立刻取出凝膠柱進行固定與染色，一般用20～30ml的注射器配上10cm長的針頭，左手拿玻管，右手握灌滿水的注射器，將針頭插入凝膠與管壁之間，左手慢慢旋轉玻管，右手一邊壓水，一邊使針頭呈螺旋式推進。靠水流壓力和潤滑力將玻璃管內壁與凝膠分開，一般情況下，針頭抽出，膠就自動滑出。如果不出，就從另一端再注水或用洗耳球在一端稍加壓力。如果膠濃度較高，取出困難，可用10%甘油水溶液代替水注入。一般剝膠的方向是從濃縮膠端開始。剝膠時應注意不要損傷膠柱表面。2025/1/3生物化學實驗原理與方法6、固定

為防止凝膠柱內已分離成分的擴散，需要進行固定。剝出的凝膠柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中幾分鐘就可達到蛋白帶固定的效果。也可浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同時進行固定和染色。如果用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和鑒定同工酶，為了讓酶帶上進行某種顯色反應，往往是先顯色后固定。三氯醋酸固定蛋白質的機制可能是這樣：其分子不僅與蛋白質帶正電荷側鏈結合，而且通過氫鍵與蛋白質的肽鏈結合，其結果使蛋白質分子失去水分子，同時在肽鏈表面包上一層疏水的CCl3基團，使蛋白質水溶性破壞，從水相沉淀在凝膠相上。乙酸固定蛋白質的機制可能同三氯乙酸一樣。2025/1/3生物化學實驗原理與方法7、染色電泳后蛋白質區(qū)帶的檢測，對于不同的目的，應采用不同的檢測方法，最常用的方法是用染料和生物大分子結合形成有色的復合物，選用染料通常應考慮以下要求：①、必須與大分子結合以形成一個不溶性的，有色的，緊密的復合物，但不結合到凝膠中和支持膜上，以便從凝膠中除去，否則背景會影響蛋白帶的辨別和定量掃描；②、染料必須容易溶解在對大分子沒有影響的溶劑中，以利于背景的脫色；③、選用高吸光系數(shù)的染料有利于提高定量測定的靈敏度；④、選用能與大分子有專一性結合的染料，并在結合后能產生不同的顏色，可以提高檢測的選擇性。2025/1/3生物化學實驗原理與方法用于蛋白質區(qū)帶染色的試劑常用的有氨基黑10B、考馬斯亮藍，1-苯胺基-8-萘磺酸等，其性能及染色原理如下：①氨基黑10B

(aminoblack10B)C22H13O12N6S3Na3MW＝715λmax＝620～630nm氨基黑是酸性染料，其磺酸基與蛋白質反應構成復合鹽。是最常用的蛋白質染料。但用氨基黑染SDS-蛋白質時效果不好。另外氨基黑染不同蛋白質時的著色度不等，色調不一(有藍、黑、棕等)，作同一凝膠柱的掃描時誤差較大，需要對各種蛋白質作出本身的蛋白質-染料量(吸收值)的標準曲線。②考馬斯亮蘭R250(CoomassiebrilliantblneR250)即三苯基甲烷(triphenylmethane)C46H44O7H3S2NaMW＝824λmax＝560～590nm染色的靈敏度比氨基黑高5倍。尤其適用于SDS電泳微量蛋白質染色，但蛋白質濃度超出一定范圍時，對高濃度蛋白的染色不合乎Beer定律，用作定量分析時要注意這點。2025/1/3生物化學實驗原理與方法③考馬斯亮蘭G250(CoomassiebrilliantblneG250)，即二甲花青亮藍(XyleneCyaninebrilliantBlue)，MW＝854，λmax＝590～610nm，染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。優(yōu)點在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色。所以常用于需要重復性好和穩(wěn)定的染色，適于作定量分析。氨基黑與考馬斯亮蘭兩種染料的共同點是：都帶有負電荷的磺酸基，能與蛋白分子上帶正電荷的側鏈相結合。但是，氨基黑分子含有較多的親水基團，和蛋白質親水微區(qū)以及親水的凝膠基質有很大的親和力。而考馬斯亮蘭卻相反，含有較多的疏水基團，和蛋白質的疏水區(qū)有較大的親和力，而和凝膠基質的親和力不如氨基黑。因此，用考馬斯亮蘭染色的漂洗要容易得多。另外，考馬斯亮蘭的靈敏度要比氨基黑高。2025/1/3生物化學實驗原理與方法④、1-苯胺基-8-萘磺酸(1-animo-naphthalsulfonicacid簡稱ANS)，MW＝241，本身無熒光，但與蛋白質結合后則產生熒光。電泳后，凝膠在此染料溶液浸1～3分鐘，用長波紫外燈照射時產生黃色熒光，可顯示蛋白質100mg，如果不明顯，可將凝膠取出暴露于空氣或鹽酸氣中，或浸沒在3mol/L鹽酸中幾秒至2分鐘，使表面蛋白質稍變性,然后再用ANS染色，這樣可顯示蛋白質20μg。這種染色優(yōu)點是可保留凝膠內中的酶和抗體的活性。可將該區(qū)帶切下來進行酶活力測定，也可直接把凝膠搗碎研細，用作抗原來注射動物，聚丙烯酰胺不影響抗體的產生。2025/1/3生物化學實驗原理與方法方法固定液染料染色時間脫色氨基黑10B甲醇7%乙酸0.1N氫氧化鈉中1%氨基黑7%乙酸中0.5%～1%氨基黑5分鐘(室溫)2小時(室溫)10分鐘(96℃)5%乙醇7%乙酸考馬斯亮蘭R25020%磺基水楊酸10%三氯乙酸樣品中含尿素的在5%三氯乙酸中固定0.25%R250水溶液10%三氯乙酸-1%R25019∶1(V/V)5%磺基水楊酸和1%R25019∶15分鐘(室溫)0.5小時(室溫)1小時(室溫)7%乙酸10%三氯乙酸90%甲酸考馬斯亮蘭G2506%乙酸12.5%三氯乙酸6%乙酸中1%G25012.5%三氯乙酸中0.1%G25010分鐘(室溫)30分鐘(室溫)甲醇-水-濃氨64∶36∶11-苯胺基-8-萘磺酸2mol/L鹽酸浸幾秒種PH6.8，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中0.003%染料3分鐘Ponceau3R12.5%三氯乙酸0.1mol/LNaOH中1%3R2分鐘(室溫)5%乙醇固綠7%乙酸7%乙酸中1%固綠2小時(5℃)7%乙酸2025/1/3生物化學實驗原理與方法8、脫色

凝膠柱染色后，先用水洗掉表面染料，然后放在脫色液中浸洗，常用的脫色液有7%乙酸，甲醇-水-乙酸溶液等。經(jīng)常更換新溶液，直到染料洗出，背景幾乎無色為止。用氨基黑染色的，脫色時間較長，而考馬斯亮藍染料易于脫色。為了短時間得出結果，可采用電泳脫色。即在一玻璃或有機玻璃槽中盛7%的乙酸溶液，已染色的膠放置在槽中間，兩邊加鉑金電極，并通直流電，電壓30～40V，電流0.5A左右，1～2小時即可脫色完畢。2025/1/3生物化學實驗原理與方法9、結果的記錄①、繪制示意圖，將各個樣品的譜帶如實地描繪下來，根據(jù)譜帶寬窄，顏色深淺，擬分七級表示之。一級寬帶譜帶色深而寬二級寬帶譜帶色淺而寬三級寬帶譜帶色極淺而寬一級窄帶譜帶色深而窄二級窄帶譜帶色淺而窄三級窄帶譜帶色極淺而窄譜帶擴散

2025/1/3生物化學實驗原理與方法②、測量相對遷移率(Rf):分離區(qū)帶的泳動速度可用相對遷移率來表示。測定遷移率時，在電泳結束后要先在指示劑移動的位置(前沿)作一標記(通常是插一根短銅絲)，染色后，量出指示劑移動的距離和酶帶移動的距離。Rf＝譜帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離 測量遷移率時，應以譜帶的中部位置為準，值得注意的是，交聯(lián)劑的濃度，交聯(lián)劑和丙烯酰胺的比例，催化劑濃度及聚膠時的溫度和時間均對凝膠柱結構有影響，因而會影響遷移率。另外，電泳時電場強度等也會影響帶電顆粒遷移速度。為了使試驗重復性好，這些因子都應盡可能保持恒定。2025/1/3生物化學實驗原理與方法③照相：采用透射照相方法，用照相機把譜帶真實地拍攝下來，盤狀電泳的凝膠柱一般放在試管中(注滿脫色液或保存液)拍攝。對于綠色、藍色和暗藍色的染色區(qū)帶，照相時可加黃濾色鏡，能增加清晰度。④光密度計掃描定量：把譜帶放在光密度掃描儀上，描繪譜帶——光密度曲線。配合計算機，可作定量分析。2025/1/3生物化學實驗原理與方法第四節(jié)、SDS一、原理

SDS(sodiumdodecylsulfate)，H25C12NaSO4M＝288.38g/mol，是一種很強的陰離子表面活性劑。SDS能破壞蛋白質分子間的結構(尤其是在強還原劑如巰基乙醇存在下，使蛋白質分子內的二硫鍵還原打開)，并以其疏水基和蛋白質分子的疏水區(qū)相結合，形成牢固的帶負電荷的蛋白質-SDS復合物。在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質的結合比為1.4gSDS/1g蛋白質。所引入的凈電荷大約為蛋白質本身的凈電荷的10倍，使得其所帶電荷遠超過蛋白質原有的凈電荷，從而清除不同蛋白質之間所帶的凈電荷不同對電泳遷移率的影響。SDS與蛋白質結合后，還引起了蛋白質構象的改變，由蛋白質-SDS復合物的流體力學和光學性質表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為10A，而長軸則隨蛋白質的分子量成正比地變化。這樣的蛋白質-SDS復合物，在凝膠電泳中遷移率，不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，遷移率只是橢圓棒的長度也就是蛋白質分子量的函數(shù)測定時，通常選用已知分子量的標準蛋白質作為“標記物”(maker)，與分子量未知的待測蛋白質樣品在同一條件下進行SDS-聚丙烯酰胺凝焦電泳，作出已知分子量的標準蛋白質的相對遷移率標準曲線，，從標準曲線上根據(jù)遷移率找出待測蛋白質樣品的分子量。2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、設備1、凝膠電泳裝置2、電源3、100度的沸水4、Eppendorf管5、微量注射器（50or100ul）6、干膠器7、帶蓋的玻璃or塑料小容器2025/1/3生物化學實驗原理與方法三、操作步驟1、制膠2、樣品準備與上樣3、電泳4、固定、染色、脫色5、分子量測定2025/1/3生物化學實驗原理與方法四、應用1、蛋白質純度的分析2、蛋白質分子量的測定3、蛋白質水解的分析4、免疫沉淀蛋白的鑒定5、免疫印跡的第一步6、蛋白質修飾的鑒定7、分離放射性標記的蛋白2025/1/3生物化學實驗原理與方法第五節(jié)、連續(xù)密度梯度電泳一、原理：如果合成的聚丙烯酰胺凝膠從上至下是一個正的線性梯度凝膠，點在凝膠頂部的樣品在電場中向著凝膠濃度逐漸增高的方向即孔徑逐漸縮小的方向遷移。隨著電泳的繼續(xù)進行，蛋白質受到孔徑的阻力越大。電泳開始時，樣品在凝膠中的遷移速度主要受到兩個因素的影響：一是樣品本身的電荷密度，二是樣品分子的大小。當遷移所受到的阻力大到阻以使樣品分子完全停止前進時，那些跑得很慢的低電荷的樣品分子將趕上與它大小相同但具有較高電荷密度的分子并停留下來形成區(qū)帶。因此在梯度凝膠電泳中，樣品的最終遷移位置僅取決于分子本身的大小，而與樣品分子的電荷密度無關。樣品混合物中分子質量大小不同的組分，電泳之后將依分子質量大小停留在不同的凝膠孔徑層次中形成相應的區(qū)帶。2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、連續(xù)密度梯度電泳的優(yōu)點1、具有使樣品中各個組分濃縮的作用，稀釋的樣品可以分次上樣，不會影響分離效果2、可提供清晰的譜帶，適合純度鑒定3、可在一張膠片上同時測定分子質量分布范圍相當大的多種蛋白質的分子質量4、可以測定天然狀態(tài)蛋白質的分子質量2025/1/3生物化學實驗原理與方法第六節(jié)、等電聚焦電泳等電聚焦(isoelectricfocusing)，縮寫為IEF或EF，也稱等電分離、等電點劃分，等電點分析、聚焦電泳等，是六十年代后期才發(fā)展起來的電泳技術，它不僅用來分離、鑒定和測定蛋白質等電點，分離復合蛋白，同時還可以結合SDS電泳，密度梯度和一般凝膠電泳進行雙向電泳來分析蛋白質的亞基，分子大小和各種蛋白質成分的圖譜。因此，它已成為電泳中不可缺少的技術。

2025/1/3生物化學實驗原理與方法一、原理：聚丙烯酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質載體，在電場的作用下會自發(fā)形成一個連續(xù)PH梯度。蛋白質樣品在電泳中被分離。運動到等電點膠層時就失去所帶電荷而穩(wěn)定停留在該處，樣品中不同蛋白質組分等電點不同，因而在等電聚焦中得到有效的分離。在等電聚焦中，利用各蛋白質組分等電點的差異，并不利用凝膠的分子篩作用。2025/1/3生物化學實驗原理與方法二、等電聚焦的關鍵問題1、用載體兩性電解質形成的PH梯度2、穩(wěn)定集中的分離了蛋白質區(qū)帶3、分離了的蛋白質的鑒定以及PH的測量

2025/1/3生物化學實驗原理與方法三、載體兩性電解質必須具備的條件1、它的化學組成應不同于被分離物，不干擾被分離物的鑒定。2、它的分子量要小，這樣便于與被分離的物質分開3、具有化學惰性，不與被分離物質反應，也不能使被分離物質變性4、在等電點處必須具有足夠的緩沖能力5、在等電點處必須具有足夠高的電導，以使一定的電流通過2025/1/3生物化學實驗原理與方法等電聚焦的優(yōu)點是：①、有很高的分辨率，可將等電點相差0.01～0.02PH單位的蛋白質分開；②、一般電泳由于受擴散作用的影響，隨著時間和所走距離加長，區(qū)帶越走越寬，而電聚焦能抵消擴散作用，使區(qū)帶越走越窄；③、由于這種電聚焦作用，不管樣品加在什么部位，都可聚焦到其等電點處，很稀的