DB3707T 133-2024 西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB16

3707濰 坊 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB3707/T133—2024西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程Technicalcodeofpracticeforidentificationofwatermelonfusariumwiltpathogen2024-12-19發(fā)布 2025-01-20實(shí)施濰坊市市場(chǎng)監(jiān)督管理局??發(fā)布DB3707/T133DB3707/T133—2024DB3707/T133DB3707/T133—2024IIIIII目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語(yǔ)和定義 1鑒定程序 1田間取樣 2癥狀檢查 2病原菌的鑒定 3過(guò)程記錄及檔案保存 4附錄A（資料性）西瓜枯萎病危害癥狀 5附錄B（資料性）馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）配制方法 6附錄C（規(guī)范性）西瓜枯萎病菌致病性測(cè)定 7附錄D（資料性）西瓜枯萎病菌菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)特征 8附錄E（資料性）西瓜枯萎病菌DNA的提取 9附錄F（資料性）西瓜枯萎病菌PCR檢測(cè) 10參考文獻(xiàn) 11前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由濰坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出、歸口并組織實(shí)施。本文件起草單位：優(yōu)奈爾生物科技有限公司、濰坊郭牌農(nóng)業(yè)科技有限公司、濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。楊珊、辛國(guó)鳳、楊琪、邢石磊。DB3707/T133DB3707/T133—2024DB3707/T133DB3707/T133—2024PAGEPAGE11PAGEPAGE10西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件適用于西瓜枯萎病菌的檢測(cè)和鑒定。規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。術(shù)語(yǔ)和定義SN/T2589-2010界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。癥狀 symptom2589—2010，定義3.2]鑒定程序西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程包括田間取樣、癥狀檢查、病原菌的鑒定、過(guò)程記錄及檔案保存4個(gè)階段。程序流程如圖1所示。圖1 西瓜枯萎病菌鑒定流程圖田間取樣（但尚未完全枯死4～8癥狀檢查癥狀檢查操作如下:觀察病株葉部有無(wú)西瓜枯萎病的可疑癥狀（見(jiàn)附錄A），如出現(xiàn)葉片萎蔫、發(fā)黃、干枯等。用小刀進(jìn)行縱切和橫切病株根部病健交界處，觀察有無(wú)西瓜枯萎病的可見(jiàn)癥狀（見(jiàn)附錄A），如基部有褐色條斑或發(fā)生表皮縱裂、維管束變褐等。（4病原菌的鑒定實(shí)驗(yàn)用儀器設(shè)備和主要試劑的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器包括生物顯微鏡、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、凝膠成像儀、電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱、-804-20（0.1μL～2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL）等。主要試劑除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。——1NaClO7530DNAPCR——試驗(yàn)中除PCR試驗(yàn)所用的試劑配制為三級(jí)水外，其他用水均為一級(jí)水。——馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）（配制方法見(jiàn)附錄B）。病原菌的培養(yǎng)直接培養(yǎng)將樣本根部用75%酒精進(jìn)行消毒處理30s后，用無(wú)菌水沖洗3遍，用1%瓊脂進(jìn)行保濕，置于28℃條件下培養(yǎng)2d～4d。分離培養(yǎng)將病株根部或莖部病健交界處切成5mm左右的小塊，在1NaClO溶液中浸泡2min，用75%酒精浸泡15s，無(wú)菌水沖洗3次，滅菌濾紙片吸干水分后放置在PSA培養(yǎng)基上，用parafilm膜封口，置于28d～3d。用挑針挑取單根菌絲接種到新鮮PSA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)5d。按照附錄C形態(tài)學(xué)鑒定用滅菌牙簽挑取按照7.2條培養(yǎng)獲得的菌絲及分生孢子，制成臨時(shí)玻片，在生物顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)特征（見(jiàn)附錄D）。病菌在PSA4d～5d分子生物學(xué)鑒定PSA5CTAB（見(jiàn)附錄E）提取可疑分離物DNA。將提取得到的DNA用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、ACT-512F/ACT-783R作為引物分別擴(kuò)增病原菌菌株的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（thenuclearribosomalinternaltranscribedspacerregion，ITS）、翻譯延伸因子（translationelongationfactor1-a，TEF-1）、組蛋白（histoneH3，HIS）、肌動(dòng)蛋白基因（actingenes，ACT）。將所獲得的片段提交測(cè)序，并根據(jù)參考序列信息構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)附錄F），從而確定可疑分離物的種類。結(jié)果判定應(yīng)采用形態(tài)學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，進(jìn)行結(jié)果判定。分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征符合7.3條描述，且根據(jù)ITS、TEF-1、HIS、ACT序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，與西瓜枯萎病菌參考菌株序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)能夠聚到一個(gè)分支上，且置信度大于95fsp。分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征符合7.3條描述，但根據(jù)ITS、TEF-1、HIS、ACT序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，與西瓜枯萎病菌參考菌株序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，能夠聚到一個(gè)分支上，但置信度不大于95sp。分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征不符合7.3條描述，可判定未檢出西瓜枯萎病菌fsp。病原菌的保存從檢測(cè)樣品中分離并鑒定為西瓜枯萎病菌的菌株應(yīng)妥善保存。將菌株接種于PSA培養(yǎng)基斜面上，在283d4-80℃超低溫冰箱中冷凍保存；或收集菌絲進(jìn)行真空干燥后于-20℃冰箱中低溫保存。試驗(yàn)結(jié)果記錄（（等；8 過(guò)程記錄及檔案保存（（和（附 錄 A（資料性）西瓜枯萎病危害癥狀d～2d，早晚尚病株癥狀 b)病株維管束病狀圖A.1 西瓜枯萎病田間發(fā)病癥狀附 錄 B（資料性）馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）配制方法將洗凈后去皮的馬鈴薯200g切成1cm左右的小塊，加水1000mL煮沸20min，用4層紗布過(guò)濾去除馬鈴薯泥，然后加入20g蔗糖，融化后定容至1000mL，加入10g～15g瓊脂后加熱使瓊脂完全溶化，將配制好的培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，塞好棉塞后用牛皮紙袋包裹，置于121℃高壓滅菌20min。附 錄 C（規(guī)范性）西瓜枯萎病菌致病性測(cè)定選取疑似枯萎病或者測(cè)序結(jié)果為枯萎病菌的純培養(yǎng)菌落，采用浸根法接種。將處于子葉平展期的西瓜苗根系漂洗干凈后，在6×106個(gè)孢子·mL-1的孢子懸浮液中浸根15min，期間搖動(dòng)孢子懸浮液3次。對(duì)照植株在無(wú)菌水中浸根15min。接種后幼苗移栽至經(jīng)過(guò)121℃高壓濕熱滅菌2h的過(guò)篩土和草炭（1:1）混合的基質(zhì)中。在人工氣候室中培養(yǎng)，溫度26℃/22℃（日/夜），光照14h/10h（日/夜），相對(duì)濕度60%，每個(gè)處理接種6株，3次重復(fù)，接種3d后剔除萎蔫和枯死的幼苗。接種4d后開(kāi)始調(diào)查記錄發(fā)病情況，21d內(nèi)持續(xù)觀察幼苗發(fā)病情況以確認(rèn)分離菌株的致病性。附 錄 D（資料性）西瓜枯萎病菌菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)特征f.sp.屬半知菌亞門真菌。病菌產(chǎn)生三種類型的孢子。病菌在PSA培養(yǎng)基平板上菌落突起，白色致密呈絮狀，菌絲體為有隔菌絲、無(wú)色，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d～5d出現(xiàn)粉紅色，小型分生孢子無(wú)色、長(zhǎng)橢圓形、單胞或偶有一個(gè)分隔。大型分生孢子鐮刀形、無(wú)色、有1個(gè)～5個(gè)隔膜、多數(shù)為3個(gè)隔膜。西瓜枯萎病菌菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)特征見(jiàn)圖D.1。菌落正面形態(tài) b)菌落背面形態(tài)c)大型分生孢子 d)小型分生孢子圖D.1 西瓜枯萎病菌形態(tài)附 錄 E（資料性）西瓜枯萎病菌DNA的提取DNA提取步驟如下：將待測(cè)菌株于285d后，收集菌絲；CTAB將破碎管放于6530min，中間顛倒混勻2次；加入等體積的苯酚/氯仿/（體積比為10min；吸取上清液至1.5mL離心管中，重復(fù)步驟d）一次；加入2倍或2.5倍的預(yù)冷無(wú)水乙醇和1/103MNaAc（pH5.2）（或用0.6倍的預(yù)冷異丙醇沉淀），室溫沉淀20min，12000rpm/min離心10min；用70%的乙醇洗滌沉淀兩次；40L或含RNsNandrop檢測(cè)DNA的純度和濃度后，保存于-20附 錄 F（資料性）西瓜枯萎病菌PCR檢測(cè)PCRDNAITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、ACT-512F/ACT-783RITS、TEF-1、HIS、ACT（F.1）。表F.1真菌鑒定用引物信息擴(kuò)增基因引物名稱引物序列退火溫度（℃）參考文獻(xiàn)ITSITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’54500-750Whiteetal.，1990ITS45’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’EFEF1-728F5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’52300-450Carbone&Kohn，1999EF1-986R5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’ACTACT-512F5’-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3’56300-450Crousetal.，2004ACT-783R5’-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3’HISCYLH3F5’-AGGTCCACTGGTGGCAAG-3’54350-400Carbone&Kohn，1999CYLH3R5’-AGCTGGATGTCCTTGGACTG-3’反應(yīng)體系：基因組DNA（20ng）1μLForardPrier10μmo·）2μLRevrs