T-HBIQA 0003.6-2024 食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法 第6部分：上魚實時熒光PCR法

T/HBIQAT/HBIQA0003.6—2024食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法DetectionofcommonHistamine-richfishderivedingredientinfoodPart6:KatsuwonuspelamisReal-timePCRmethod2024-08-15發(fā)布2024-10-15實施河北省檢驗檢疫學(xué)會發(fā)布T/HBIQA0003-2024《食品中常見高組2本部分適用于食品中鰹魚源性成分的定性檢測。本部分所規(guī)定方法的最低檢出限（LOD）為0.1%2規(guī)范性引用文件GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分3.1鰹魚Scomberjaponicas又俗名炸彈魚，屬鱸形目（Perciformes）、金槍魚科（Thunnidae）、3.2實時熒光PCRreal-3.3Ct值cyclethreshol4.1PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）4.2DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）4.3ATP-6：線粒體基因atp合成酶復(fù)合物亞基64.4dNTP：脫氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphat4.5CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrithylammoniumbromide）4.6Tris：三（羥甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethan4.7EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic4.8FAM：羧基熒光素（carboxyfluorescei提取樣品DNA為模板，以鰹魚ATP-6基因中相對保守且高度特異的引物和探針進(jìn)行目標(biāo)物的實時熒光3因ATP-6基因），），6.9熒光PCR預(yù)混液（2×)。）：8檢驗步驟魚罐頭、魚腸、魚丸等食品通常取肉糜300mg，置于三氯甲烷:甲醇:水混4上清液至另一新離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，混勻后室溫下靜置1h。12000r/min離心10備用。也可用等效的商業(yè)化DNA提取試劑盒提取樣品DNA。取適量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別測定260nm和28c=A260×N×50··························（1）c——DNA濃度，單位為微克每微升(μg/μLN——核酸稀釋倍數(shù)。實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見表2。每個樣品各做兩個平行管，可先將反應(yīng)試劑及引物預(yù)混成混合液。表2實時熒光PCR反應(yīng)體系終濃度反應(yīng)體系/μLF(10μmol/L)1R(10μmol/L)1P(10μmol/L)1DNA模板(50-100ng/μL)——），檢驗過程中分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。以鰹魚提取的DNA為陽性對照，以已知不含有鰹魚的樣品提取的DNA為陰性對照，以滅菌水為空白對照。樣品、陽性對照、陰性對照、空白對照各設(shè)置兩個平行。5c)陽性對照：有熒光對數(shù)增長，且熒光通道出d)內(nèi)參照：被檢樣品有熒光對數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct