《水稻鎘穩(wěn)定低積累品種篩選和鑒定技術規(guī)范（征求意見稿）》

DB32DB32/TXXXX-20242024–XX–XX發(fā)布2024–XIDB32/TXXXX-2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由江蘇省農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)村廳提出、歸口并組織實施。本文件起草單位：江蘇省耕地質(zhì)量與農(nóng)業(yè)環(huán)境保護站、南京農(nóng)業(yè)大學、中國科學院南京土壤研究所、江蘇省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測監(jiān)控有限公司、久田環(huán)境科技南京有限公司。本文件主要起草人：汪鵬、唐仲、姜海波、駱永明、趙方杰、董歌、鄭順安、杜兆林、李真、邱丹、何振艷、陳彩艷、邱一格、范玉健、張明超、梁曉輝。2DB32/TXXXX-2024水稻鎘穩(wěn)定低積累品種篩選和鑒定技術規(guī)范本文件規(guī)定了水稻鎘穩(wěn)定低積累品種篩選和鑒定的技術步驟和要求。本文件適用于江蘇省主栽水稻品種中鎘低積累水稻品種的篩選與鑒定工作，可為其他地區(qū)類似工作提供參考。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB2762食品安全國家標準食品中污染物限量GB5084農(nóng)田灌溉水質(zhì)標準GB5009.15食品安全國家標準食品中鎘的測定GB15618土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風險管控標準NY/T674轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測DNA提取和純化NY/T1300農(nóng)作物品種區(qū)域試驗技術規(guī)范水稻DB32∕T2853農(nóng)作物品種試驗技術規(guī)范水稻HJ1315土壤和沉積物19種金屬元素總量的測定電感耦合等離子體質(zhì)譜法DB32/T1124水稻品種田間試驗記載規(guī)范DB43/T860雜交水稻種子真實性和純度鑒定SSR分子標記法HNZ218水稻品種鎘積累特性大田驗證試驗技術規(guī)程HNZ219水稻品種鎘積累特性多點篩選試驗技術規(guī)程3術語和定義本標準的試驗品種、對照品種、品種試驗的相關定義按NY/T1300的規(guī)定執(zhí)行。4試驗設置試驗組劃分、試驗點選擇及試驗點數(shù)量的設置按NY/T1300的相關規(guī)定執(zhí)行。5試驗品種5.1試驗品種申請條件與要求試驗品種的申請條件、申請材料、品種數(shù)量、種子質(zhì)量及試驗時間按NY/T1300的相關規(guī)定執(zhí)行。試驗品種應為適宜當?shù)胤N植且通過省部級（農(nóng)作物品種審定委員會）審定的水稻品種。5.2對照品種選擇3DB32/TXXXX-2024每組試驗需設置3個對照品種：常規(guī)對照品種：按NY/T1300的規(guī)定選擇適合當?shù)胤N植的主流水稻品種。鎘低積累對照品種：選用日本晴或中花11。鎘高積累對照品種：選用揚稻6號。6試驗田選擇6.1試驗田基本條件試驗田應選擇當?shù)卮硇缘牡咎?，滿足以下條件：?肥力：土壤養(yǎng)分等級為中級及以上，土壤性質(zhì)和肥力均勻。?排灌：方便可靠，田塊形狀規(guī)正、大小合適。?土壤鎘含量：土壤總鎘含量應低于GB15618《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風險管控標準》中規(guī)定的管制值。6.2試驗點選擇?試驗點選擇：參照DB32∕T2853執(zhí)行，開展多點篩選試驗工作，設置7個試驗點。?土壤要求：試驗田土壤（0-20cm）全鎘含量范圍為0.10－1.50㎎/㎏，且分布較均勻（三個重復土壤全鎘含量變幅≤10%，土壤pH值≤6.0的試驗點數(shù)不少于50%。?灌溉條件：試驗田需具備穩(wěn)定、清潔的灌溉水源，灌溉水符合GB5084要求。6.3土壤樣品采集及制備?采樣時間：試驗移栽前30天。?采樣方法：采用5點取樣法，從試驗田5個不同位置采集土樣，采樣深度為0～20cm，每點采樣0.3kg，混合后總樣品量為1.5kg。?檢測項目：土壤全鎘含量。?檢測時間：在區(qū)域試驗與生產(chǎn)試驗期間。?檢測方法與標準：按照HJ1315標準中鎘含量測定方法執(zhí)行。?檢測評價：對每塊試驗田按照GB15618標準定性評價各田塊的土壤環(huán)境質(zhì)量等級。6.4灌溉水樣品采集及制備?采樣時間：在水稻孕穗期，從大田進水口采集2500mL水樣。?檢測項目：灌溉水中鎘含量。?檢測時間：在區(qū)域試驗與生產(chǎn)試驗期間檢測。?檢測方法與標準：按照GB5084標準中推薦的測試方法和標準執(zhí)行。?檢測評價：對每塊試驗田灌溉水樣品根據(jù)GB5084標準進行灌溉水質(zhì)等級評價。7田間設計品種篩選試驗采用完全隨機區(qū)組設計，具體要求如下：7.1區(qū)組設置與重復次數(shù)?區(qū)組設計為完全隨機排列，重復3～4次。?每個品種種植5～6行，每行栽植6～8株。4DB32/TXXXX-20247.2區(qū)組試驗田塊要求?區(qū)組試驗應安排在同一田塊內(nèi)進行，確保試驗條件一致性。?區(qū)組排列方向需結(jié)合試驗田實際情況，以利于水流方向和田間操作。7.3保護行設置?試驗區(qū)域四周須設置保護行，保護行不少于5行，均種植對照品種。7.4操作道設計?區(qū)組之間及試驗區(qū)與保護行之間應設置操作道，寬度不超過40cm。7.5田間布局參考?田間區(qū)組及品種排列布局參照附錄A，其余設置按NY/T1300的相關規(guī)定執(zhí)行。8栽培管理8.1一般原則播種、移栽及相關操作按NY/T1300的規(guī)定執(zhí)行，確保試驗過程的規(guī)范性。8.2試驗田準備?無論秧田還是本田，翻耕后需要反復耙勻、耙平至少3次，以保證試驗田的平整性。?控制小區(qū)間土壤鎘含量誤差最小，前茬稻樁需徹底分解后再翻耕1～2次。?試驗田須便于排水，確保管理操作的便捷性。8.3肥水管理?肥水管理參照HNZ219執(zhí)行，禁止使用鈣鎂磷肥、過磷酸鈣、石灰，以免影響試驗結(jié)8.4其他要求?其他管理措施：按照當?shù)卮筇锷a(chǎn)的常規(guī)習慣進行，以保證試驗的實際適應性。?田間記載項目和標準參照HNZ218水稻品種鎘積累特性大田驗證試驗技術規(guī)程執(zhí)行9檢驗9.1取樣水稻進入黃熟期后，各品種種植小區(qū)采用5點取樣法進行取樣。每個品種種植小區(qū)取10穴樣品、每穴采集2個主分蘗穗，將其混合形成一個籽粒樣品。每個品種種植小區(qū)采集5株以上水稻的幼嫩葉片，混合形成一個葉片樣，低溫保存?zhèn)溆谩?.2糙米中鎘含量測定檢測參照GB5009.15執(zhí)行，分析并依據(jù)GB2762評價各品種的鎘積累特性，同時整理并列出數(shù)據(jù)表以供分析和比較。5DB32/TXXXX-20249.3水稻品種的基因型鑒定樣品采集與DNA提?。嚎蓮牟煌酒贩N的任何生長期及任何組織中采集樣品，提取品種基因組DNA，利用分子標記鑒別基因型。DNA提取及純化方法參照NY/T674執(zhí)行。PCR擴增：以不同水稻品種基因組DNA為模板，分別采用qGCd2、LCd-11、LCd-38和LCd-41分子標記引物進行PCR擴增（引物信息見附錄）。PCR擴增體系及反應條件按DB43/T860執(zhí)行。酶切處理：LCd-11、LCd-38和LCd-41分子標記的PCR擴增產(chǎn)物進行相應的限制性內(nèi)切酶酶切（見附錄C酶切體系及反應條件如下：PCR產(chǎn)物10μL，10XCutFastBuffer2μL，內(nèi)切酶1μL，ddH2O7μL；、37℃反應15分鐘。電泳檢測：酶切產(chǎn)物及qGCd2PCR擴增產(chǎn)物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測方法參照DB43/T860的規(guī)定執(zhí)行?；蛐团卸ǎ和ㄟ^電泳條帶的大小和位置判定高鎘基因型和低鎘基因型（見附錄B）。qGCd2：高鎘基因型PCR產(chǎn)物電泳條帶為183bp，低鎘基因型條帶為149bp；LCd-11：高鎘基因型酶切PCR產(chǎn)物電泳條帶為100bp，低鎘基因型條帶為75bp；LCd-38：高鎘基因型酶切PCR產(chǎn)物電泳條帶為112bp，低鎘基因型條帶為86bp；LCd-41：高鎘基因型酶切PCR產(chǎn)物電泳條帶為114bp，低鎘基因型條帶為86bp。9.4水稻品種主要農(nóng)藝性狀測定水稻品種篩選田間試驗的主要農(nóng)藝性狀及綜合評價參照DB32/T1124執(zhí)行。10低鎘積累水稻品種判定根據(jù)不同水稻品種籽粒鎘含量和基因型鑒定結(jié)果，結(jié)合代表性穩(wěn)定低鎘積累特征的水稻品種（日本晴或中花11）的籽粒鎘含量，對低鎘積累品種進行評定。低鎘積累品種評定標準：?籽粒鎘含量：品種籽粒鎘含量不高于日本晴或中花11籽粒鎘含量值的20%。?水稻品種基因型：4條分子標記（qGCd2、LCd-11、LCd-38、LCd-41）的基因型均為低鎘基因型。符合上述條件的水稻品種評定為穩(wěn)定低鎘積累水稻品種。其他性狀指標的評價參照NY/T1300的相關要求執(zhí)行。6DB32/TXXXX-2024（資料性）品種篩選試驗田間區(qū)組設計及品種排列示意圖7DB32/TXXXX-2024（資料性）4種分子標記鑒定高鎘和低鎘積累水稻品種基因型的差異8DB32/TXXXX-2024（資料性）qGCd2CCCATTGATTAGTTCCCTGATTTTTCACATAAGCAAAATCTTCTTCCCTGACGAAGTTGACAATGTTGCTCATCTCCCTGTTGGGTTTTATTTGCCAGCTCCGAGAGAGGCTGCCTGTCATGGAGGACATATGCGGTTTTGTATAGTATAAGGTAATCAGATAAGGTCATTGCGGTATGLCd-11RCTTCCGCATACCACTGAACTTGTTTGTTTGTGTGGTGCTTTACAATGTAAGTGAAAGTGTTCTTACTGAATCTCATGATTCTAATCTGTTGATTTCCTTCAAAAATAACATTTTTTTCTGTGAATTTTGCAGGTGAATGCATTCCCTATCACTGTCATGTTTGGCATGTGTTCTATCTTCCTCTTCATGGCGGCAATCCTGCAGAGACGGCTAATGGTTGTTTCTGACCTACACAAATCATCGACAAGTATGCATCTTTCTTCATTACTCCACATATAAAAACTAAAATCGCTTTGCCAATCAATTTCTTTGATTCCTAACTGTTGGGGTTAACATTTTCTGCAGAAGCACAAGAGATGGWTGATGAAGATGAGCCACTGAATCCTTAAGGLCd-38GTCACAAAGAAGAAATAATGGCACCATGGTAACTATGCAAGTGGTGAAAGTCTTCAACTGAAAAACCATTTGCTTTTGTTTTCCTTATGGTGCAGTATTCTAACCAAATCAAGAATCATATGTAGAGATTGCAGGGTATTTTATATTTTAATGAAACATTTCACAGGATAAGCATACAGATGCCTTCTCCAATACTGGCTTCAGACAAAAGCAAAGGATATCAGCTAAGACAGAATGATGATGTCATTGGCAGGCAGCAGGGAAGTGGTAAAAGCACCCACAYTGTGTAGGTAAGCATTCCATAAGLCd-41FGGCTCTCAACTCAAGTATTCATCCTTCTGAAATCTGATTTCTCTCTTTCCAATTACCAGTTTTTTTTTTTTTTACTTTCCTCCTGAATAATCTCACTGCTTTAAATTCCTGATATCTTATGATGAAACTGCAAAATGTAAATTCAGA