T-QGCML 4275-2024 肉松食品中單核細胞增生李斯特氏菌的測定

ICS07.100.30CCSC53肉松食品中單核細胞增生李斯特氏菌的測定DeterminationofListeriamonocytogenesinmeatfloppingsIT/QGCML4275—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4設(shè)備和材料 5培養(yǎng)基和試劑 6檢驗方法 27操作步驟 28結(jié)果報告 3T/QGCML4275—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由運城市綜合檢驗檢測中心提出。本文件由全國城市工業(yè)品貿(mào)易中心聯(lián)合會歸口。本文件起草單位：運城市綜合檢驗檢測中心、運城市市場監(jiān)管綜合行政執(zhí)法隊、山西大學、玖零零幺質(zhì)量研究院（山西）有限公司。本文件主要起草人：韓珍珍、竇夢璇、曹本男、王彬、王彪、師娟、薄濤、李宣英。本文件為首次發(fā)布。1T/QGCML4275—2024肉松食品中單核細胞增生李斯特氏菌的測定本文件規(guī)定了肉松食品中單核細胞增生李斯特氏菌測定的設(shè)備和材料、培養(yǎng)基和試劑、檢驗方法、操作步驟和結(jié)果報告。本文件適用于肉松食品中單核細胞增生李斯特氏菌的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.30—2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4設(shè)備和材料4.1從各超市抽取零售散裝的豬肉松、雞肉松、牛肉松共167份，所有樣品均用無菌采樣袋密封包裝。4.2除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：a)生物安全柜；b)生化培養(yǎng)箱；c)均質(zhì)器；d)顯微鏡帶照相系統(tǒng)，10倍～100倍（油鏡）；e)濁度儀；f)全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)；g)單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC19114或其他等效標準菌株）；h)金黃色葡萄球菌（ATCC6538或其他等效標準菌株）；i)馬紅球菌（ATCC6939或其他等效標準菌株）；j)英諾克李斯特氏菌（ATCC33090或其他等效標準菌株）；k)伊氏李斯特氏菌（ATCC19119或其他等效標準菌株）；l)斯氏李斯特氏菌（ATCC35967或其他等效標準菌株）。5培養(yǎng)基和試劑測定過程中使用的培養(yǎng)基和試劑如下：a)李氏增菌肉湯LB（LB1、LB2b)PALCAM瓊脂；d)單核細胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒；2T/QGCML4275—2024e)李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基；f)GP鑒定卡。6檢驗方法6.1.1按GB4789.30—2016規(guī)定的方法進行。共取樣品n=5進行檢驗，依次編號為01～05，共5組，每組做2個平行，步驟依次為增菌、分離、初篩、鑒定和計數(shù)。6.1.2檢測前應(yīng)對實驗室的環(huán)境及關(guān)鍵培養(yǎng)基及菌種進行驗證，確保試驗準確。7操作步驟7.1增菌以無菌操作取樣品25g（mL）放入含有225mLLB1增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mLLB2增菌液的均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min。于（30±1）℃培養(yǎng)（24±1）h，移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mLLB2增菌液內(nèi)，于（30±1）℃培養(yǎng)（24±1）h。7.2分離取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24h～48h，觀察各個平板上生長的菌落。典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說明進行判定。7.3初篩自選擇性瓊脂平板上分別挑取獨立區(qū)域的3個～5個典型或可疑菌落（可以根據(jù)經(jīng)驗排除部分藍綠色菌落，如周圍無暈圈的藍綠色小菌落分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于（36±1）℃培養(yǎng)（24±1）h，同時在TSA-YE平板上劃線，于（36±1）℃培養(yǎng)18h～24h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進行鑒定。7.4鑒定7.4.1溶血試驗將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為20個～25個小格，挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個菌落，并刺種陽性對照菌（單核細胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），穿刺時應(yīng)接近底部，但不要觸到底面，同時避免瓊脂破裂。于（36±1）℃培養(yǎng)24h～48h，于明亮處觀察，單核細胞增生李斯特氏菌呈現(xiàn)窄清晰明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈，英諾克李斯特氏菌無溶血圈，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24h～48h再觀察。7.4.2協(xié)同溶血試驗在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間，垂直線兩端不應(yīng)觸及平行線，距離1mm～2mm，同時接種單核細胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌，于（36±1）℃培養(yǎng)24h～48h。單核細胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約2mm的β-溶血增強區(qū)域，斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強區(qū)域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現(xiàn)約5mm～10mm的“箭頭狀”3T/QGCML4275—2024β-溶血增強區(qū)域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24h～48h再觀察。7.4.3生化試劑盒及全自動生化鑒定儀鑒定從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取目標菌落，先利用濁度