T-CVMA 171-2024 豬圓環(huán)病毒1型、2型、3型三重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法

T/CVMA171—2024檢測(cè)方法Real-timePCRmethodfordetectionofporcinecircovirustype1,2and32024-7-4發(fā)布2024-7-4實(shí)施中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布I本文件由洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司1本文件描述了豬圓環(huán)病毒1型、2型、3型三重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的試劑與材料、儀器與設(shè)備、實(shí)驗(yàn)本文件適用于豬血液、肺、扁桃體或腦等病灶組織及環(huán)境樣品中豬圓環(huán)病毒1型、2型、3型的核酸2規(guī)范性引用文件NY/T541實(shí)時(shí)熒光PCR：實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timePolymeraseChainReCt值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（CDNA：脫氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicacPCV2：豬圓環(huán)病毒2型（PorcinecircovPCV3：豬圓環(huán)病毒3型（PorcinecircovVIC：綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotei5試劑和耗材2選取商品化的病毒DNA提取試劑盒進(jìn)行豬圓環(huán)病毒DNA提取。也可按照GB/5.3陰性對(duì)照和陽性對(duì)照5.5其他試劑6儀器與耗材豬血液、肺、扁桃體或腦等病灶組織及環(huán)境樣品的采集按照NY/T541相采集或處理好的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于-80℃保存，避），3將采集的肺、扁桃體或腦等病灶組織及環(huán)境樣品，稱取樣品約1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05g于按照所選取的病毒DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2×OneStepQProbeMix/PCV2-上游引物PCV2-下游引物PCV2-探針PCV3--上游引物PCV3-下游引物PCV3-探針PCV1-上游引物PCV1-下游引物PCV1-探針DNA模板/5RNase-freeddH2O/2min14在每個(gè)循環(huán)的第二步（60℃35s）采集熒光注：ABI系列熒光定量PCR儀不選RO9結(jié)果判定9.2試驗(yàn)成立條件9.2.1陽性對(duì)照：FAM通道、VIC通道和CY5通道Ct值均≤30，且呈典型的S型曲線。9.2.2陰性對(duì)照：FAM通道、VIC通道和CY5通道Ct值均＞38或無Ct值，無典9.2.39.2.1和9.2.2要求須在同一次試驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次試驗(yàn)9.3判定標(biāo)準(zhǔn)被檢樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35，且曲線呈典型的被檢樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≥38或無Ct值，無被檢樣本檢測(cè)結(jié)果35＜Ct值＜38，且曲線呈典型的S型曲線，判為可疑。需再進(jìn)行1次復(fù)檢，做3個(gè)重復(fù)，至少2個(gè)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果Ct值＜38，且曲線呈典型的S型曲線，判為豬圓環(huán)病毒1型核酸陽性；否則被檢樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35，且曲線呈典型的被檢樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≥38或無Ct值，無被檢樣本檢測(cè)結(jié)果35＜Ct值＜38，且曲線呈典型的S型曲線，判為可疑。需再進(jìn)行1次復(fù)檢，做3個(gè)被檢樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35，且曲線呈典型的被檢樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≥38或無Ct值，無被檢樣本檢測(cè)結(jié)果35＜Ct值＜38，且曲線呈典型的S型曲線，判為可疑。需再進(jìn)行1次復(fù)檢，做3個(gè)重復(fù)，至少2個(gè)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果Ct值＜38，且曲線呈典型的S型曲線，判為豬圓環(huán)病毒3型核酸陽性；否則9.3.4多通道結(jié)果描述與判定5FAM通道樣本不含有豬圓環(huán)病毒1、2、3型核酸6A.1陽性對(duì)照核酸序列連接到pUC18載體中，制成陽性質(zhì)粒pUC-PCV-1/2/7TM值/℃1PCV2上游RCCCC-3’47.72PCV2下游CAGAT-3’3PCV2探針GTCCCAGCTGTAGA-BHQ1-3’4PCV3上游GGATGCTC-3’5PCV3下游CAAAA-3’6PCV3探針ATACCGGGCAG-BHQ1-3’7PCV1上游G