DB51T 1523-2012 桑蠶白僵病診斷技術規(guī)程　　

DB51DB51/T1523—2012桑蠶白僵病診斷技術規(guī)程2012-12-20發(fā)布2013-03-01實施四川省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I 1 14試劑 1 1 38附錄A 4Ⅱ本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由四川省農業(yè)廳提出并歸口。本標準由四川省質量技術監(jiān)督局發(fā)布。本標準起草單位：四川省蠶業(yè)管理總站、四川省農業(yè)科學院生物技術與核技術研究所、樂山市蠶種質量檢疫檢驗站、內江市蠶種質量監(jiān)督檢驗站。本標準主要起草人：吳鋼、蔡平鐘、張學清、馬露蕓、顏建平、何東。11范圍2規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義4試劑4.1酒精[w(CH?CH?OH)=70%]。4.2分析用水按GB/T6682規(guī)定執(zhí)行。4.3馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(見附錄A)。5.2載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、吸管、玻璃棒、分裝漏斗，量筒、燒杯、錐形瓶(500mL、250mL)、試管(10mm×75mm),樣品袋、凍存管(1.8mL、5mL),解剖剪、鑷子、接種針/環(huán)、牛皮紙、不銹鋼鍋(1000mL～2000mL)、電爐(500w~1000w)、藥勺、紗布、棉塞。6觀察6.1外觀觀察26.1.1幼蟲癥狀期發(fā)病，多呈半脫皮或不脫皮蠶；瀕死時排軟糞，吐胃液，體液略呈乳白色弛，略有彈性，后逐漸變硬；死后1d~2d,尸體的氣門、口器及節(jié)間膜處長出菌絲及白色粉末，逐漸6.1.2蛹、蛾癥狀出菌絲及白色粉末；蛾期發(fā)病，不能產卵，死后尸體干癟，翅、足易折斷。6.2顯微鏡觀察6.2.1樣品采集采集6.1描述的典型個體癥狀病蠶，置于樣品袋或凍存管中，做好記載。6.2.2樣品處置6.2.2.1樣品保存樣品隨機分成2份，一份作為檢樣供檢驗；另一份作為備樣，保存于0℃~4℃冰箱中，保存期6.2.2.2樣品制備6.2.2.2.1取瀕死病蠶，經酒精[w(CH?CH?OH)=70%]進行蠶體消毒，用解剖剪剪去尾角，滴1滴～2滴血液，涂抹于載玻片上(過干或過濃時，可滴加1滴～3滴無菌水),蓋上蓋玻片，制成鏡檢樣本。6.2.2.2.2用鑷子夾取病死蠶尸體覆蓋的白色粉末，置于載玻片上，滴入1滴～3滴無菌水，搗爛，蓋6.2.3鏡檢觀察將鏡檢樣本分別置于顯微鏡(15×40倍或16×40倍)下觀察，每個樣本觀察不少于20個視野。6.3接種觀察按6.2.2.2.1方法取3頭~6頭出現相同癥狀病蠶血液各1滴～3滴，或按6.2.2.2.2的方法取3頭~6頭病蠶(蛹)身上的白色粉末各少許，分別置于無菌試管中，各加1滴~3滴無菌水，用無菌玻6.3.2分離培養(yǎng)將6.3.1制備的血液或白色粉末樣品，用接種環(huán)(針)劃線接種于馬鈴薯蔗糖瓊脂無菌培養(yǎng)基上，在28℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d~5d。6.3.3接種取6.3.2培養(yǎng)基上出現的白色粉末5接種環(huán)～10接種環(huán)于無菌試管中，加5mL～10mL無菌水，3用無菌玻璃棒攪拌均勻，浸無菌桑葉或拌合無菌人工飼料喂食2齡~3齡桑蠶，常規(guī)飼育5d~10d。通過外觀觀察，桑蠶出現6.1表述癥狀時，可初步診斷為白僵病。7.2顯微鏡觀察判定7.2.1按照6.2.3鏡檢觀察6.2.2.2.1樣本，發(fā)現有圓筒形或長卵圓形芽生孢子時，樣品可確診為桑蠶白7.3接種觀察判定當按照6.3接種后的桑蠶出現6.1.1描述癥狀，且按6.2.2.2.1、6.2.2.2.2制備鏡檢樣本，鏡檢觀察分別與7.2.1、7.2.2一致時，樣品可確診為桑蠶白僵病。4(資料性附錄)A.1成分及比例A.2制備方法A.2.1將盛有1000mL水的不銹鋼鍋置于電爐上加熱。A.2.2稱洗凈去皮新鮮馬鈴薯200g,切成約1cm3的小塊，放入加熱的不銹鋼鍋中，煮沸10min~20A.2.3用紗布過濾，濾液倒回不銹鋼鍋中，加入少量熱水至1000mL,再置于電爐上加熱至沸騰。A.2.4加入稱好的蔗糖20g、瓊脂15g,不斷攪拌至瓊脂完全溶化，停止加熱。A.2.5補充熱水至1000mL,充分攪勻，用分裝漏斗將其分裝至試管(每管約4mL)或培養(yǎng)皿(2mm~