T-CSHB 0010-2024 豬瘟熒光PCR 快速檢測技術(shù)規(guī)范

T/CSHBTechnicalspecificationsforrapiddetectionofswinefeverusingPCR2024-7-22發(fā)布I 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 5試劑和材料 6儀器與設(shè)備 7樣品采集與處理 8檢測 9存儲 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由唐山怡安生物工程有限公司提出。本文件由河北省版權(quán)協(xié)會歸口。本文件起草單位：唐山怡安生物工程有限公司、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所、北京動物疫病預(yù)防控制中心、河北省動物疫病預(yù)防控制中心、四川省動物疫病預(yù)防控制中心、杭州依思康醫(yī)藥科技有限公司、唐山獸醫(yī)檢驗檢測研究院有限公司、河北國安生物工程有限公司、蘇州潤利生物技術(shù)有限公司、北京快樂星生物科技有限公司、北京貝妥妥動物保健科技有限公司、河北寶盈生物技術(shù)有限公司、北京寶易生物技術(shù)有限公司、華北理工大學(xué)、中德信息技術(shù)（天津）有限公司。本文件主要起草人：李潤、劉靜、裴雅芳、陳兆婧、李辰龍、陳晴、李麗、李松勵、李明、劉激雨余琦、張啟龍、馬宏偉、韋景平、顧文源、韓慶安、陳斌、吳超、柴文琴、查銀河、舒建洪、高云、楊廣利、李振義、鐘啟迪、楊曉明、楊宇、安志軍。1豬瘟熒光PCR快速檢測技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了豬瘟熒光PCR快速檢測技術(shù)的試劑和材料、儀器設(shè)備、樣品的采集與處理、操作方法、結(jié)果判定和存儲。本文件適用于豬瘟快速檢測，適用于對臨床樣本中的豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）RNA進(jìn)行定性檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存于運輸技術(shù)規(guī)范GB/T27540-2011豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。擴(kuò)增Amplification指基因擴(kuò)增，細(xì)胞內(nèi)染色體上的某一個基因選擇性地拷貝數(shù)大量增加的現(xiàn)象。3.2擴(kuò)增曲線AmplificationCurve指在分子生物學(xué)實驗中，通過連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)體系內(nèi)生物分子的濃度變化，得到的曲線圖。4縮略語熒光PCR：熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）FAM：6-羧基熒光素（6-carboxfluorescein）CSFV：豬瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）2DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethlpyrocarbonate）5試劑和材料除另有說明，所有試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶的容器分裝。5.1.1RNA核酸提取試劑盒5.1.2PCR反應(yīng)液5.1.3陽性對照品5.1.4陰性對照品5.1.5酶混合液5.1.6DEPC水去離子水中加入0.1%DEPC，37°C作用1h121±2）°C，高壓滅菌15min。5.2材料放血工具、離心管、一次性手套、真空采血管（含EDTA抗凝劑）、研缽/組織勻漿器、開口器、消毒劑、編號筆、消毒液容器、拭子等。6儀器與設(shè)備6.1核算提取儀6.2高速臺式冷凍離心機(jī)：可控溫至4°C，離心速度可達(dá)12000g以上6.3渦旋震蕩儀6.4冰箱：2~8°C和-20°C以下6.5適用儀器試劑盒適用于ABI7000/7300/7500/7900、ABIStepOnePlus、宏石SLAN-48P/96S、RochelightCycler480、RochelightCycler96、AglientMX3000P/3005P、iCycleriQ、Bio-RadCFX96等熒光定量PCR儀。37樣品采集與處理樣品采集、保存與運輸按照NY/T541執(zhí)行，樣本類型為RNA病毒，且需在提取后盡快檢測。7.2采樣人員采樣人員需經(jīng)過專業(yè)技術(shù)機(jī)構(gòu)培訓(xùn)、掌握采樣技術(shù)的人員實施。7.3樣品采集7.3.1全血樣品采集生豬樣品采集部位為豬耳緣靜脈或前腔靜脈血液，生豬采集2mL~5mL血液置于真空采血管（含EDTA抗凝劑）中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.3.2拭子樣品采集用無菌拭子在鼻腔內(nèi)或口腔內(nèi)輕輕擦拭并緩慢旋轉(zhuǎn)至少3周，或用無菌拭子輕輕擦拭眼分泌物后，將拭子置于DEPC水中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.3.3內(nèi)臟組織樣品采集采集適量肝、脾、肺組織樣品，并按1：5倍體積加入DEPC水，研磨勻漿，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.3.4糞便樣品采集稱取適量糞便樣品置入無菌保存管中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.3.5活體樣品采集固定活豬的上唇，用開口器打開口腔，用采樣槍采取扁桃體樣品，用滅活牙簽挑至無菌管中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.4樣品處理7.4.1全血樣品處理血液混勻后，轉(zhuǎn)入容量為1.5mL滅菌離心管中，直接用于核酸提取。7.4.2拭子樣品處理4將含有鼻咽拭子或口腔拭子或眼分泌物拭子樣品，搖勻，保存管在渦旋震蕩儀上充分混合，在4°C以下3000rpm離心5min，取上清液，轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中。7.4.3內(nèi)臟組織和糞便樣品處理將含有組織或糞便勻漿液無菌保存管在渦旋振蕩儀上充分混合后，在4°C以下3000rpm離心15min，取上清液。7.4.4活體組織樣品處理取適量樣本于研缽或組織勻漿器中充分研磨，3000rpm15min，取上清液。8檢測8.1檢測方法8.1.1核酸提取在樣本制備區(qū)進(jìn)行。按照GB/T27540-2011執(zhí)行。8.1.2擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備在試劑存儲和準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。將試劑盒從-20°C冰箱取出，冰浴條件下融化，待其融化完全后，振蕩混勻，瞬時離心，并按表1體系，在0.2mLPCR管中配制反應(yīng)液。表1擴(kuò)增試劑配制成分體積CSFV-PCR反應(yīng)液酶混合液總體積20μL8.1.3熒光PCR擴(kuò)增體系將提取的樣本RNA，取5μL上樣。8.1.4PCR擴(kuò)增按如下步驟設(shè)置熒光定量PCR儀的程序：表2操作步驟步驟溫度循環(huán)數(shù)150°C5min295°C395°C40cycle62°C30s（采集熒光步驟）5儀器檢測通道選擇：選擇FAM通道（Reporter：FAM）檢測CSFV；具體檢測通道設(shè)置可參照各儀器使用說明。8.2檢測結(jié)果說明通過檢測樣本擴(kuò)增曲線和Ct值組合判定，陽性/陰性，具體數(shù)值如下：1、檢測質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：如果陽性對照品有擴(kuò)增曲線且Ct值≤30，空白對照的無擴(kuò)增曲線，則本次試驗有效，否則試驗無效。2、結(jié)果判斷：a）如果檢測樣本有擴(kuò)增曲線且Ct值≤35，報告為CSFV檢測陽性。b）如果檢測樣本有擴(kuò)增曲線且