《肝素酶活性的測(cè)定》

ICS07.080

CCSA40

CBPIA

中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/XXXXXXX—XXXX

肝素酶活性的測(cè)定分光光度法

Determinationoftheactivityofheparinlyase—Spectrophotometricmethod

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布

T/XXXXXXX—XXXX

肝素酶活性的測(cè)定分光光度法

1范圍

本文件描述了測(cè)定肝素酶活性的分光光度法。

本文件適用于生化試劑、工業(yè)酶制劑中肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

肝素酶活性單位heparinlyaseactivityunit

在30℃、pH7.0的條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol4,5-不飽和糖醛酸所需的酶量。

注：一個(gè)酶活性單位以U表示。

4原理

肝素酶催化底物肝素或硫酸乙酰肝素裂解會(huì)生成4,5不飽和糖醛酸。4,5不飽和糖醛酸在232nm波長(zhǎng)

下有特征吸收，通過(guò)監(jiān)測(cè)232nm下的吸光度的變化來(lái)測(cè)定4,5不飽和糖醛酸的生成速率，計(jì)算酶活性。

5試劑

除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

5.1肝素鈉：注射級(jí)。

5.2硫酸乙酰肝素：分析純。

5.3鹽酸溶液：濃度為6mol/L。

量取500mL濃鹽酸，加水稀釋混勻后定容至1000mL。

5.4肝素酶Ⅰ及肝素酶Ⅱ的反應(yīng)底物溶液：含20mmol/L三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、1.2mmol/L氯

化鈣（CaCl2）、150mmol/L氯化鈉（NaCl）及8.3g/L肝素鈉，pH7.0。

準(zhǔn)確稱取0.121gTris、0.0067gCaCl2、0.438gNaCl及0.415g肝素鈉（5.1），溶解在40mL的水中，

使用鹽酸溶液（5.3）調(diào)節(jié)pH至7.0后，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶定容，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.5肝素酶Ⅲ的反應(yīng)底物溶液：含20mmol/LTris、1.2mmol/LCaCl2、150mmol/LNaCl及16.7g/L硫

酸乙酰肝素，pH7.0。

準(zhǔn)確稱取0.121gTris、0.0067gCaCl2、0.438gNaCl及0.835g硫酸乙酰肝素（5.2），溶解在40mL

的水中，使用鹽酸溶液（5.3）調(diào)節(jié)pH至7.0后，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶定容，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

6儀器設(shè)備

6.1分析天平：感量為0.1mg。

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6.2pH計(jì)：精度為0.01。

6.3紫外-可見分光光度計(jì)：波長(zhǎng)精度為1nm，吸光度值精度為0.001。

6.4恒溫水浴槽：精度為0.5℃。

6.5磁力攪拌器。

6.6石英比色皿：1cm。

6.7容量瓶：50mL、1000mL。

6.8燒杯：50mL、1000mL。

6.9量筒：50mL、500mL。

6.10移液器:10μL、100μL、1mL。

7試樣制備和試驗(yàn)步驟

7.1試樣酶液的制備

7.1.1液體樣品待測(cè)酶液制備

移取肝素酶液體樣品溶于水中進(jìn)行稀釋，使待測(cè)酶液中的肝素酶活性控制在5U/mL～30U/mL。

7.1.2固體樣品待測(cè)酶液制備

稱取肝素酶固體樣品（精確至0.0001g）溶于水中，使待測(cè)酶液中的肝素酶活性控制在5U/mL～30

U/mL。

7.2測(cè)定

準(zhǔn)確移取1mL反應(yīng)底物溶液于石英比色皿中，置于分光光度計(jì)的保溫槽內(nèi)，待溫度穩(wěn)定于30℃后，

迅速加入10μL待測(cè)酶液，加蓋顛倒混勻后立即放入分光光度計(jì)，在232nm下掃描20min，保存吸光度

曲線。選取曲線平滑且線性的60s區(qū)段，通過(guò)線性回歸方程計(jì)算斜率。

8試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

8.1液體樣品

試樣中肝素酶活性按式（1）計(jì)算：

()××

=

×·····················································(1)

????1+????2????????

式中：????1????????2

X1——肝素酶活性，單位為酶活性單位每毫升（U/mL）

V1——反應(yīng)底物溶液的體積，單位為微升（μL）；

V2——酶活性測(cè)定中加入酶液的體積，單位為微升（μL）；

k——酶活性測(cè)定中吸光度曲線斜率，單位為吸光度每分鐘（Abs/min）；

D——稀釋倍數(shù)；

ε——吸光系數(shù)，單位為mM-1cm-1（取值為3.8mM-1cm-1）。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

8.2固體樣品

試樣中肝素酶活性按式（2）計(jì)算：

()×

=×

×···················································(2)

????1+????2????????0

式中：????2????????2m

X2——肝素酶活性，單位為酶活性單位每克（U/g）

V1——反應(yīng)底物溶液的體積，單位為微升（μL）；

2

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V2——酶活性測(cè)定中加入酶液的體積，單位為微升（μL）；

k——酶活性測(cè)定中吸光度曲線斜率，單位為吸光度每分鐘（Abs/min）；

ε——吸光系數(shù)，單位為mM-1cm-1（取值為3.8mM-1cm-1）；

V0——溶解酶粉的液體體積，單位為毫升（mL）；

m——稱取酶粉的質(zhì)量，質(zhì)量為克（g）。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

9精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)算數(shù)平均值的10%。

10試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括下列內(nèi)容：

a)試樣本身必要的詳細(xì)說(shuō)明；

b)