拓展學(xué)習(xí)資料7 液相色譜儀常見問題及解決

高效液相色譜儀使用中常見問題及解決方法高效液相作為一種高精密儀器，如果在使用過程中不按照正確操作的話，就容易導(dǎo)致一些問題。其中最常見的就是柱壓問題、漂移問題、峰型異常問題。柱壓問題柱壓問題是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個恒定值而是指壓力波動范圍在345kPa以內(nèi)或在50psi（針對Waters高效液相色譜儀）之間（在使用梯度洗脫時，柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的）。壓力過高、過低都屬于柱壓問題。壓力過高這是高效液相在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時，我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。

(1).首先斷開真空泵的入口處，此時PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個小時，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過濾頭正常，在檢查；

(2).打開Purge閥，使流動相不經(jīng)過柱子，如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。處理方法：將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個小時。如果壓力降至100PSI以下，過濾白頭正常，在檢查；

(3).把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動相更強(qiáng)的流動相沖至壓力正常。假如按上面的方法長時間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用流動相沖洗柱子。這時，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。問題無法解決可考慮更換色譜柱。流速設(shè)定不正確：可重新設(shè)定正確流量。流動相配比不正確：不同配比的流動相其黏度系數(shù)不相同，較高黏度的流動相相應(yīng)的系統(tǒng)壓力也大，如果可能可更換黏度較小的溶劑或重新設(shè)定配比。系統(tǒng)壓力零點漂移：調(diào)節(jié)壓力傳感器的零點。阻尼器堵塞：拆下后進(jìn)行超聲波清洗或更換新的阻尼器。進(jìn)樣器堵塞：參見說明書清洗。管路或連接口堵塞：更換被堵塞管路或按說明書進(jìn)行清洗。柱端過濾器堵塞：拆下過濾器用硝酸超生清洗長期使用柱端固定相板結(jié)：挖掉板結(jié)部分修補(bǔ)柱端10、分析生化、染料等易污染固定相的樣品：方法同上，采用保護(hù)柱

壓力過低一般是由于系統(tǒng)泄漏，處理方法：尋找各個接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。拆下柱子加適當(dāng)力擰緊或襯四氟薄膜。2、泵里進(jìn)了空氣，但此時表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽高忽低，更嚴(yán)重一點會導(dǎo)致泵無法吸上液體。處理方法：打開Purge閥，用3~5ml/min的流速沖洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。3、無流動相流出：檢查儲液瓶中有無流動相，沉子是否浸在流動相中，泵是否運行。4、參比閥未關(guān)閉：將流速降低后關(guān)閉參比閥。一般降至0.1～0.2mL/min后關(guān)閉參比閥。其它壓力問題壓力傳感器故障，柱壓升高或降低或無柱壓:與供應(yīng)商聯(lián)系進(jìn)行維修。系統(tǒng)管路中存在氣泡，柱壓不穩(wěn)：重新進(jìn)行排氣操作。(可重復(fù)多次，直至氣泡排出)沉子表面的小孔被堵塞，柱壓在較大范圍內(nèi)波動：將沉子取下后進(jìn)行超聲波清洗?；€問題基線漂移基線漂移是色譜工作者普遍遇到的問題，在實際工作中，我們經(jīng)常能遇到基線漂移的情況，特別是在梯度洗脫的時候，基線漂移是常有的事。一般說來，機(jī)器剛起動時，基線容易漂移，大概要30min的平衡時間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長下（220nm）平衡時間相對會比較長，但如果你在實驗過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：1、柱溫波動控制好柱子和流動相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱。(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。)控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器。

2、流通池被污染或有氣體用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池（最好斷開柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）。

3、紫外燈能量不足更換新的紫外燈

4、流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。檢查流動相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑。

5、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間。在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。

6、檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處將波長調(diào)整至最大吸收波長處

7、流動相的PH值沒有調(diào)節(jié)好加適量的酸或堿調(diào)至最佳PH值流動相不均勻:(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。)使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑，流動相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用氦氣。檢測器出口阻塞:(高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線)取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。流動相配比不當(dāng)或流速變化:更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。柱平衡慢特別是流動相發(fā)生變化:用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動相時，在分析前用10～20倍體積的新流動相對柱子進(jìn)行沖洗。使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調(diào)整:重新設(shè)定基線。當(dāng)檢測器動力學(xué)范圍發(fā)生變化時，使用新的流動相?；€噪音對于紫外檢測器，氘燈光源打開后要預(yù)熱30min以上，基線才能穩(wěn)定。噪聲是指與被測物無關(guān)的檢測器輸出信號的隨機(jī)擾動變化，分短期噪聲和長期噪聲兩種。氘燈用的過久，接近壽命期時(氘燈的壽命約1000h)，會使基線噪音明顯增加，應(yīng)及時更換氘燈。除光源外，流路中的氣泡也會產(chǎn)生噪音。對于判斷基線噪聲增大是由于光源燈的老化還是來自流路中的氣泡的問題，可將泵關(guān)上，繼續(xù)走基線，如果噪聲立即停止，基線呈一條直線，說明基線噪聲來自流動相中的氣泡，應(yīng)設(shè)法排氣;若停泵后仍有噪音出現(xiàn)，應(yīng)考慮是燈的問題。電化學(xué)檢測器中的工作電極(安培型)對氣泡十分敏感，儀器的平衡時間較長。流路中如果有氣泡存在，不僅基線會出現(xiàn)尖峰，還會影響檢測。因此，做電化學(xué)檢測時，流動相的配制要很嚴(yán)格，水要超純、除還原物，配好后一定要過濾脫氣，還應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。如果泵系統(tǒng)不是PK材料，即電化學(xué)分析專用儀器，而是普通的高效液相色譜不銹鋼泵，應(yīng)對系統(tǒng)中的不銹鋼材料的輸液泵、進(jìn)樣器和管道，在分析前用6mol·L-1硝酸溶液鈍化(注意斷開分離柱)，可縮短基線平衡時間。還可在流動相中加入EDTA離子隱蔽劑，也是可以的。如果有較大的氣泡進(jìn)到檢測器中，光靠泵沖可能太慢，可暫時將泵停止，關(guān)上電化學(xué)檢測器，拆下工作電極，用超純水沖洗電極表面，也很奏效的，但對液相色譜技術(shù)不太熟練的技術(shù)員要小心操作，不宜反復(fù)這樣拆卸?；€噪音(規(guī)則的)產(chǎn)生基線噪音的原因有：在流動相、檢測器或泵中有空氣；漏液；流動相混合不完全；溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱)；在同一條線上有其他電子設(shè)備；泵振動。為了避免基線噪音，在正式進(jìn)樣之前，需要對流動相脫氣；沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣；檢查管路接頭是否松動；泵是否漏液；是否有鹽析出和不正常的噪音，如有必要，更換泵密封；用手搖動使溶劑混合均勻或使用低粘度的溶劑減少差異或加上熱交換器；有其他電子設(shè)備時斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正；泵振動時在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。基線噪音(不規(guī)則的)1、漏液：檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封，檢查流通池是否漏液。2、流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成：檢查流動相的組成。3、流動相各溶劑不相溶：選擇互溶的流動相。4、檢測器/記錄儀電子元件的問題：斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正。5、系統(tǒng)內(nèi)有氣泡：用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng)；檢測器內(nèi)有氣泡，清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器。6、流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音):用硝酸清洗流通池;7、檢測器燈能量時不足更換燈;8、色譜柱填料流失或阻塞:更換色譜柱。9、流動相混合不均勻或混合器工作不正常:維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，不建議使用泵的混合裝置。保留時間保留時間漂移保留時間的漂移往往由柱老化引起，而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是由于不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失(例如通過水解)，色譜柱污染(由樣品或流動相所致)等。保留時間漂移的幾種最常見的原因和解決方法如下：1、色譜柱平衡如果觀察到保留時間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已經(jīng)平衡。在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱。通常平衡需要10～20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑(如離子對試劑)則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱。流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成分。2、固定相穩(wěn)定性固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的pH范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例如，硅膠基質(zhì)在pH=4時水解穩(wěn)定性最好，水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定；長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。3、色譜柱污染保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)，如:配藥中的賦形劑，生化樣品(如血清)中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加，可以通過使用固相提取(SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響，避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設(shè)計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解，DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護(hù)柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。4、流動相組成流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等，應(yīng)防止流動相由于蒸發(fā)、反應(yīng)等等原因造成的變化。5、疏水坍塌當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌，此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進(jìn)行平衡。由是色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱(如WatersSymmetryShieldRP色譜柱)或非端基封口的色譜柱(如WatersResolve色譜柱)也可避免發(fā)生坍塌。保留時間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個重要標(biāo)志，同一種東西，兩次的保留時間相差不要超過15s，超過了半分鐘可看做保留時間漂移，就無法進(jìn)行定性，你要考慮以下原因：

1、溫控不當(dāng)：調(diào)好柱溫，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱。

2、流動相比例變化：檢查四元泵的比例閥是否有故障

3、色譜柱沒有平衡：在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱

4、流速變化：重新設(shè)定流速

5、泵中有氣泡：從泵中除去氣泡流量變化：在正確使用流速與流動相的前提下檢查泵是否存在問題，比如漏液與在線混合的準(zhǔn)確性。7、流動相的問題：使用預(yù)混合則要注意每次配液的準(zhǔn)確性，精密度與PH的變化。有可能是流動相被污染或加入的添加劑對被測組分的干擾。、8、色譜柱被污染：正/反相沖洗色譜柱或更換新色譜柱。9、梯度滯后時間設(shè)置不正確：檢查泵和流路系統(tǒng)維護(hù)記錄，確定很多系統(tǒng)最后使用之前有無調(diào)整。如有變化，重新計算新的梯度滯后體積。10、色譜柱使用問題：不同的色譜柱尺寸與填料對同一物質(zhì)的保留時間是不同的。同一批樣品的分析最好使用同一色譜柱。11、系統(tǒng)不平衡：應(yīng)該用充足的時間來平衡整個系統(tǒng)，特別在色譜柱第一次使用離子對試劑時，要有充足時間和流動相體積來平衡色譜柱。每次開機(jī)使用時平衡時間至少為0.5～1h，在改變流動相時也需要0.5h來重新平衡柱子。保留時間波動保留時間有的縮短，有的延長，有的上下波動，保留時間波動的主要原因：色譜柱溫度范圍控制的不好，溫度波動太大；流動相當(dāng)中組分發(fā)生變化；色譜柱沒有平衡；流動相流速發(fā)生變化；泵中有氣泡；流動相選擇不恰當(dāng)?shù)?。解決辦法：嚴(yán)格控制柱子的溫度，室內(nèi)溫度保持恒定，上下波動二度為宜；流動相的組成恒定，防止變化(蒸發(fā)、反應(yīng)等)；色譜柱在每一次運行之前給予足夠的時間平衡；選擇合適的流動相或者混合流動相，并使流速保持恒定，發(fā)生變化時重新設(shè)定流速；管線內(nèi)有氣泡時要用脫氣機(jī)進(jìn)行脫氣并時時監(jiān)控保持。

4峰型異常問題峰型問題是液相的主要問題，在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型，對于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對待，從主要問題出發(fā)，一個一個加以解決。

1、色譜圖中未出峰系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解；泵未輸液或流動相使用不正確；檢測器設(shè)置不正確；針對以上情況成因作相應(yīng)調(diào)整即可。

2、一個峰或幾個峰是負(fù)峰流動相吸收本底高；進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣；樣品組分的吸收低于流動相。

3、所有峰均為負(fù)峰信號電纜接反或檢測器輸出極性設(shè)置顛倒；光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡。

4、所有峰均為寬峰系統(tǒng)未達(dá)到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動相差很多；色譜柱尺寸及類型選擇不正確；色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低；溫度變化造成的影響。、

5、所出峰比預(yù)想的小樣品黏度過大；進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差；檢測器設(shè)置不正確．定量環(huán)體積不正確；檢測池污染；檢測器燈出現(xiàn)問題。

6、出現(xiàn)雙峰或肩峰進(jìn)樣量過大；樣品濃度過高；保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞；保護(hù)拄或色譜柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。前伸峰：進(jìn)樣量或樣品濃度高，溶解樣品的溶劑較流動相極性強(qiáng)；保護(hù)柱或色譜柱污染或失效。①柱溫低：升高柱溫；②樣品溶劑選擇不恰當(dāng)：使用流動相作為樣品溶劑；③樣品過載：降低樣品含量；④色譜柱損壞：更換柱子。

8、拖尾峰：柱超載，降低樣品量；增加柱直徑采用較高容量的固定相；峰干擾，對樣品進(jìn)行清潔過濾；調(diào)整流動相；硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值；柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼；加在線過濾器，對樣品進(jìn)行過濾；死體積或柱外體積過大，將連接點降至最低；盡可能使用內(nèi)徑較細(xì)的連接管；柱效下降，更換柱子；采用保護(hù)柱，對柱子進(jìn)行再生。色譜峰拖尾是色譜分析中最常見問題之一。產(chǎn)生的原因很多，早期的液相色譜柱由于封尾技術(shù)原因，硅膠基質(zhì)上的硅羥基殘留多，被分析物與色譜柱間的相互作用導(dǎo)致峰拖尾，認(rèn)為是殘留硅羥基與分析物中的游離氨基與硅羥基的氫鍵作用力的結(jié)果。峰拖尾一般發(fā)生在堿性化合物上，這是由于殘留的硅羥基和帶正電荷的堿性化合物之間的相互作用引起的。這也是許多有機(jī)含氮藥物色譜峰拖尾的原因，解決這類藥物拖尾的方法有加入掃尾劑、磷酸鹽、或者加入離子對試劑。一般可以得到有效的解決。當(dāng)流動相的值大于4.5～5.0時，色譜柱表面的硅羥基會帶負(fù)電荷，因此，消除峰拖尾的最有效方式是使用pH值小于4的緩沖流動相。由于硅羥基的活性和離子化會降低，因此選擇更換新的高純羥基化硅膠色譜柱也會減少峰拖尾。目前色譜填充技術(shù)已相對成熟，許多色譜柱甚至可以達(dá)到硅羥基的完全封尾但是對很多藥物色譜拖尾仍然非常嚴(yán)重，因此硅羥基作用力只是造成色譜峰拖尾的可能原因之一。出現(xiàn)平頭峰檢測器設(shè)置不正確；進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高。

10、出現(xiàn)鬼峰進(jìn)樣閥殘余峰，可能為上次樣品的殘余。在每次進(jìn)完樣后用充足的時間來平衡和清洗系統(tǒng)；樣品中存在未知物，改進(jìn)樣品的預(yù)處理；流動相污染，更換新流動相，盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，隔夜的流動相再次使用時要過濾；盡可能使用HPLC級試劑；流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大流速排除。峰分叉①保護(hù)柱或分析柱污染：取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析，如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞，拆下來清洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染，運用適當(dāng)?shù)脑偕胧Ｈ绻麊栴}仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。②樣品溶劑不溶于流動相改變樣品溶劑，如果可能采取流動相作為樣品溶劑。峰變形樣品過載，減少樣品載量。早出的峰變形樣品溶劑選擇不恰當(dāng)①減少進(jìn)樣體積②運用低極性樣品溶劑早出的峰拖尾程度大于晚出的峰柱外效應(yīng)①調(diào)整系統(tǒng)連接(使用更短、內(nèi)徑更小的管路)②使用小體積的流通池K’增加時，拖尾更嚴(yán)重（1）二級保留效應(yīng)，反相模式①加入三乙胺(或堿性樣品)②加入乙酸(或酸性樣品)③加入鹽或緩沖劑(或離子化樣品)④更換一支柱子（2）二級保留效應(yīng)，正相模式①加入三乙胺(或堿性樣品)②加入乙酸(或酸性樣品)③加入水(或多官能團(tuán)化合物)④試用另一種方法（3）二級保留效應(yīng)，離子對加入三乙胺(或堿性樣品)16、酸性或堿性化合物的峰拖尾緩沖不合適①使用濃度50～100mM的緩沖液②使用Pka等于流動相pH值的緩沖液17、額外的峰（1）樣品中有其他組分：正?，F(xiàn)象；（2）、前一次進(jìn)樣的洗脫峰：①增加運行時間或梯度斜率②提高流速；（3）空位或鬼峰：①檢查流動相是否純凈②使用流動相作為樣品溶劑③減少進(jìn)樣體積。5結(jié)語

以上內(nèi)容只是對液相色譜中出現(xiàn)的常見的問題進(jìn)行了分析，當(dāng)然在我們實際應(yīng)用當(dāng)中還會遇到更多的其它問題，在故障排除時要遵守以下原則：一次只改變一個因素，確定假定因素與問題之間的聯(lián)系；如果通過更換組件來排查故障時要注意將拆下的完好組件裝回原位，避免浪費；養(yǎng)成良好的記錄習(xí)慣，這是成功進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵?？傊?，在使用高效液相色譜時一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養(yǎng)。輸液泵的常見故障及對策輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量精確和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件，目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵，主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個單向閥組成，用馬達(dá)帶動凸輪驅(qū)動柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運動。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。1單向閥故障由于球與閥座密封不嚴(yán)，液體倒流，造成壓力不穩(wěn)，甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)主要是污染或氣泡引起，球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染，流動相應(yīng)使用HPLC級的溶劑，并且配好的流動相一定要用0.45u濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時應(yīng)打開泄液閥，最后再用所用的溶液沖洗整個系統(tǒng)。氣泡進(jìn)入閥中會緊貼在閥體的一側(cè)，使寶石球難返回到閥座，引起倒流，泵的壓力和流速會明顯改變。此時，應(yīng)立即打開泄液閥，大流量(2ml/min)沖洗泵，直至排除液為直線型。因為甲醇可潤濕泵內(nèi)壁，擠出氣泡，故也可使用脫過氣的甲醇沖洗泵。長期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡，即用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭，擰開輸出管道的壓帽，手動泵送液，可見到氣泡從孔中擠壓出來，直至無氣泡排出將壓帽擰緊[3]。采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)定，應(yīng)考慮是否密封墊壞了?或單向閥磨損、球不光滑等，需更換部件。2泵墊圈故障泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液，因為這會損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運動著的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運動而流動相不漏出來，它是液相色譜系統(tǒng)中最易磨損的部件。有條件的實驗室可三個月更換一次墊圈，防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動相則更會加速墊圈的磨損，應(yīng)及時沖洗。當(dāng)墊圈損壞時，表現(xiàn)為:泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個現(xiàn)象，應(yīng)盡快更換新墊圈。為避免上述故障的發(fā)生，我們在分析工作中應(yīng)注意以下幾點:①使用超純水(18MΩ.cm)、純度級別較高的試劑和色譜級溶劑配制流動相;②配好的流動相一定要抽濾脫氣，即便儀器有在線脫氣裝置，也最好在上機(jī)前進(jìn)行抽濾。真空抽濾既過濾顆粒也脫了氣泡，非常有效。③泵在起動前一定要通過泄液閥抽凈泵里的空氣。④用緩沖鹽洗脫時，分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個流路系統(tǒng)，不要讓腐蝕性溶液滯留泵中，最后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。色譜分離柱的使用與維護(hù)在前述儀器工作原理部分，我們已經(jīng)指出，液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實現(xiàn)的。我們目前工作中多采用反相色譜柱，如何保護(hù)好分離柱減少柱的污染是延長柱壽命的關(guān)鍵。1怎樣維護(hù)好色譜分離柱加保護(hù)柱(預(yù)柱)是保護(hù)分離柱的有效辦法。保護(hù)柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱，接在分離柱之前，或代替流路過濾器。保護(hù)柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾，這些垃圾如果直接進(jìn)入分離柱會逐漸堆積在柱頭，最終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品，如分析血漿樣品，一般分析50個樣品后需更換新柱芯。避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓，但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊，這將改變柱床體積，影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有:進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動、泵啟動太快、柱切換等操作。用手動進(jìn)樣閥時的壓力變化不大，自動進(jìn)樣閥由于切換較慢，可能會造成壓力沖擊。合理選擇分離柱。我們知道，選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點，一是根據(jù)待測組分的分子量的大小;二是根據(jù)流動相條件，包括PH值、離子強(qiáng)度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動相PH值在3-7之間，極端PH值(>8)的流動相能溶解硅膠，使鍵合相流失。而目前利用先進(jìn)的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料(如Waters公司的XTerra色譜柱)，集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點為一體，使有機(jī)硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表面位置的硅羥基，使這種新型填料具有分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、PH范圍寬(1-12)的優(yōu)勢，其性能突破了傳統(tǒng)高效液相色譜柱的極限。所以一定要根據(jù)分析的對象、流動相的條件選擇合適的分離柱，茫然時可向公司的技術(shù)人員咨詢。定期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時，沖洗完緩沖鹽后，最后要過度到用強(qiáng)溶劑沖洗柱子，如可用色譜純甲醇、乙腈沖洗反相C18柱，目的是沖去吸附在柱上的強(qiáng)保留組分。如果用甲醇/水為流動相也應(yīng)這樣沖洗柱子，在一定程度上可恢復(fù)柱效。2怎樣減少柱的污染?最有效的辦法是純化樣品。我們在多年的分析工作中發(fā)現(xiàn)，凡是樣品純化的越干凈，分離柱的壽命就越長;反之，只有提取沒有純化的樣品，分離柱柱效下降較快。建立一個理想的色譜分析方法應(yīng)該有一套有效的樣品前處理方法，特別是在分析血漿和尿液樣品時，要特別注意樣品的提取與純化，盡量使處理過的樣品中雜質(zhì)(如大分子蛋白、有機(jī)物等)降到最低，保護(hù)柱頭和柱子。提取純化好的樣品最好用流動相來溶解，一方面減少色譜圖中的溶劑峰干擾，另一方面也是檢查樣品在流動相中的溶解性，如果樣品進(jìn)樣后在流動相中沉淀，會堵塞進(jìn)樣器和柱頭，甚至樣品分解，出現(xiàn)怪峰。如果出現(xiàn)樣品與流動相不溶要設(shè)法改變?nèi)芙鈼l件，如更換樣品溶劑，或改進(jìn)處理樣品的方法，或過濾，去除不溶性物質(zhì)。檢測器的常見故障及對策液相色譜儀常用的檢測器主要有紫外、熒光和電化學(xué)檢測器。這些檢測器的作用就是收集流經(jīng)色譜分離柱的各組分在檢測器中的信號，根據(jù)組分光吸收值/熒光強(qiáng)度/電極表面電流的變化計算出組分的濃度[4]。各檢測器常見故障主要有:1基線噪音較大和對策對于紫外檢測器，氘燈光源打開后要預(yù)熱30分鐘以上，基線才能穩(wěn)定。氘燈用的過久，接近受命期時(氘燈的壽命約束1000小時)，會使基線噪音明顯增加，應(yīng)及時更換氘燈。除光源外，流路中的氣泡也會產(chǎn)生噪音。怎樣判斷基線噪音增大是由于光源燈的老化還是來自流路中的氣泡?可將泵關(guān)上，繼續(xù)走基線，如果噪音立即停止，基線呈一條直線，說明基線噪音來自流動相中的氣泡，應(yīng)設(shè)法排氣;若停泵后仍有噪音出現(xiàn)，應(yīng)考慮是燈的問題。電化學(xué)檢測器中的工作電極(安培型)對氣泡十分敏感，儀器的平衡時間較長。流路中如果有氣泡存在，不僅基線會出現(xiàn)尖峰，還會影響檢測。因此，做電化學(xué)檢測時，流動相的配制要很嚴(yán)格，水要超純、除還原物，配好后一定要過濾脫氣，還應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。如果泵系統(tǒng)不是PK材料，即電化學(xué)分析專用儀器，而是普通的高效液相色譜不銹鋼泵，應(yīng)對系統(tǒng)中的不銹鋼材料的輸液泵、進(jìn)樣器和管道，在分析前用6mol/L硝酸溶液鈍化(注意斷開分離柱)，可縮短基線平衡時間。還可在流動相中加入EDTA離子隱蔽劑，也是可以的。如果有較大的氣泡進(jìn)到檢測器中，光靠泵沖有時太慢，可暫時將泵停止，關(guān)上電化學(xué)檢測器，拆下工作電極，用超純水沖洗電極表面，也很奏效的，但對液相色譜技術(shù)不太熟練的技術(shù)員要小心操作，不宜反復(fù)這樣拆卸。2檢測器污染及對策管道污染阻塞是檢測器常見故障。當(dāng)流動相用了緩沖鹽更換流動相又不當(dāng)時，常會在檢測器管路中產(chǎn)生沉淀，可先用5倍柱積的水沖洗，再用10倍柱積的強(qiáng)溶劑(如乙腈)流過，再用50倍的柱體積的異丙醇沖洗，最后換上反相流動相平衡。當(dāng)檢測器管路堵塞時，可表現(xiàn)為柱壓升高，此時，應(yīng)和柱頭堵塞相區(qū)分?？蓴嚅_柱子，直接接檢測器，如泵壓仍較高，可判斷壓力升高是由于檢測器管道堵塞造成。檢測器進(jìn)口是常發(fā)生阻塞的地方，正向沖洗效果常不明顯，我們的經(jīng)驗是將檢測器進(jìn)出口管道對調(diào)，用6mol/L硝酸溶液反沖檢測器，能很快將阻塞沖開，但要注意用低流速沖洗，觀察壓力變化。檢測池阻塞和污染多見紫外檢測器。池阻塞也可用上述方法反沖，一般都能疏通。通常，池阻塞的故障比較少見，而池污染常發(fā)生，如不干凈的樣品在池窗上積聚等，都會造成檢測池污染。表現(xiàn)為基線噪音增大，儀器靈敏度下降?？捎米⑸淦饕来嘶爻楫惐?、6mol/L硝酸，要小心操作，將池中的污物沖洗干凈，最后用100ml純水正向沖洗檢測池。反向沖洗還可防止池滲漏。對于電化學(xué)檢測器，要注意維護(hù)工作電極表面的清潔度，當(dāng)檢測器檢測了大量較臟的樣品(如血漿、尿液)或用的過久，應(yīng)用化學(xué)法或物理拋光法對電極表面進(jìn)行清潔，可提高一定的檢測靈敏度，但要注意，最后一定要用純水沖洗干凈，不要帶來其它污染。高效液相色譜儀的保養(yǎng)高效液相色譜的工作條件溫度：10~30°C；相對濕度<80%；最好是恒溫、恒濕，遠(yuǎn)離高電干擾、高振動設(shè)備。泵的保養(yǎng)1)使用流動相盡量要清潔，流動相要過濾后再用；2)進(jìn)液處的沙芯過濾頭要經(jīng)常清洗；3)流動相交換時要防止沉淀；4)避免泵內(nèi)堵塞和進(jìn)入氣泡;進(jìn)樣器的保養(yǎng)每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染。柱的保養(yǎng)柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動；2)當(dāng)柱子和色譜儀連接時，連接處和管路一定要清洗干凈；3)流動相一定要脫氣后再使用；4)避免使用高黏度的溶劑作為流動相，同時要避免使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿做流動相；5)待分析樣品要過濾、純化；6)嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；7)每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；8)每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑瓷V柱；9)若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存柱子并將其封閉；檢測器(UV)的保養(yǎng)1)紫外燈的保養(yǎng)：在分析前，柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器，減少紫外燈的使用。2)分析完后，樣品池要嚴(yán)格進(jìn)行清洗。6、對整套儀器的保養(yǎng)對經(jīng)常使用的儀器要按以上操作對各部件進(jìn)行維護(hù)與保養(yǎng)。對常期不用的儀器要定期開機(jī)運行，最好每周開機(jī)2h左右，以便對其性能及潛在問題能及時了解。編輯后分析與排查儀器簡單故障高效液相作為一種高精密儀器，如果在使用過程中不按照正確操作的話，就容易導(dǎo)致一些問題。其中最常見的就是柱壓問題、漂移問題、峰型異常問題。柱壓問題柱壓問題是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個恒定值而是指壓力波動范圍在345kPa以內(nèi)或在50psi（針對Waters高效液相色譜儀）之間（在使用梯度洗脫時，柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的）。壓力過高、過低都屬于柱壓問題。壓力過高：這是高效液相在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升高。一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時，我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。首先斷開真空泵的入口處，此時PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個小時，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過濾頭正常，在檢查；打開Purge閥，使流動相不經(jīng)過柱子，如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。處理方法：將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個小時。如果壓力降至100PSI以下，過濾白頭正常，再檢查；把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動相更強(qiáng)的流動相沖至壓力正常。假如按上面的方法長時間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用流動相沖洗柱子。這時，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。問題無法解決可考慮更換色譜柱。流速設(shè)定不正確：可重新設(shè)定正確流量。流動相配比不正確：不同配比的流動相其黏度系數(shù)不相同，較高黏度的流動相相應(yīng)的系統(tǒng)壓力也大，如果可能可更換黏度較小的溶劑或重新設(shè)定配比。系統(tǒng)壓力零點漂移：調(diào)節(jié)壓力傳感器的零點。阻尼器堵塞：拆下后進(jìn)行超聲波清洗或更換新的阻尼器。進(jìn)樣器堵塞：參見說明書清洗。管路或連接口堵塞：更換被堵塞管路或按說明書進(jìn)行清洗。柱端過濾器堵塞：拆下過濾器用硝酸超生清洗。長期使用柱端固定相板結(jié)：挖掉板結(jié)部分修補(bǔ)柱端。分析生化、染料等易污染固定相的樣品：方法同上，采用保護(hù)柱。壓力過低一般是由于系統(tǒng)泄漏，處理方法：尋找各個接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。拆下柱子加適當(dāng)力擰緊或襯四氟薄膜。泵里進(jìn)了空氣，但此時表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽高忽低，更嚴(yán)重一點會導(dǎo)致泵無法吸上液體。處理方法：打開Purge閥，用3~5ml/min的流速沖洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。無流動相流出：檢查儲液瓶中有無流動相，沉子是否浸在流動相中，泵是否運行。參比閥未關(guān)閉：將流速降低后關(guān)閉參比閥。一般降至0.1～0.2mL/min后關(guān)閉參比閥。其他壓力問題壓力傳感器故障，柱壓升高或降低或無柱壓:與供應(yīng)商聯(lián)系進(jìn)行維修。系統(tǒng)管路中存在氣泡，柱壓不穩(wěn)：重新進(jìn)行排氣操作。(可重復(fù)多次，直至氣泡排出)沉子表面的小孔被堵塞，柱壓在較大范圍內(nèi)波動：將沉子取下后進(jìn)行超聲波清洗?；€問題基線漂移基線漂移是色譜工作者普遍遇到的問題，在實際工作中，我們經(jīng)常能遇到基線漂移的情況，特別是在梯度洗脫的時候，基線漂移是常有的事。一般說來，機(jī)器剛起動時，基線容易漂移，大概要30min的平衡時間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長下（220nm）平衡時間相對會比較長，但如果你在實驗過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：柱溫波動控制好柱子和流動相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱。(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。)控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器。流通池被污染或有氣體用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池（最好斷開柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）。紫外燈能量不足更換新的紫外燈流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。檢查流動相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑。樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間。在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處將波長調(diào)整至最大吸收波長處。流動相的PH值沒有調(diào)節(jié)好加適量的酸或堿調(diào)至最佳PH值。流動相不均勻:(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。)使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑，流動相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用氦氣。檢測器出口阻塞:(高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線)取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。流動相配比不當(dāng)或流速變化:更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。柱平衡慢特別是流動相發(fā)生變化:用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動相時，在分析前用10～20倍體積的新流動相對柱子進(jìn)行沖洗。使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調(diào)整:重新設(shè)定基線。當(dāng)檢測器動力學(xué)范圍發(fā)生變化時，使用新的流動相?；€噪音對于紫外檢測器，氘燈光源打開后要預(yù)熱30min以上，基線才能穩(wěn)定。噪聲是指與被測物無關(guān)的檢測器輸出信號的隨機(jī)擾動變化，分短期噪聲和長期噪聲兩種。氘燈用的過久，接近壽命期時(氘燈的壽命約1000h)，會使基線噪音明顯增加，應(yīng)及時更換氘燈。除光源外，流路中的氣泡也會產(chǎn)生噪音。對于判斷基線噪聲增大是由于光源燈的老化還是來自流路中的氣泡的問題，可將泵關(guān)上，繼續(xù)走基線，如果噪聲立即停止，基線呈一條直線，說明基線噪聲來自流動相中的氣泡，應(yīng)設(shè)法排氣;若停泵后仍有噪音出現(xiàn)，應(yīng)考慮是燈的問題。電化學(xué)檢測器中的工作電極(安培型)對氣泡十分敏感，儀器的平衡時間較長。流路中如果有氣泡存在，不僅基線會出現(xiàn)尖峰，還會影響檢測。因此，做電化學(xué)檢測時，流動相的配制要很嚴(yán)格，水要超純、除還原物，配好后一定要過濾脫氣，還應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。如果泵系統(tǒng)不是PK材料，即電化學(xué)分析專用儀器，而是普通的高效液相色譜不銹鋼泵，應(yīng)對系統(tǒng)中的不銹鋼材料的輸液泵、進(jìn)樣器和管道，在分析前用6mol·L-1硝酸溶液鈍化(注意斷開分離柱)，可縮短基線平衡時間。還可在流動相中加入EDTA離子隱蔽劑，也是可以的。如果有較大的氣泡進(jìn)到檢測器中，光靠泵沖可能太慢，可暫時將泵停止，關(guān)上電化學(xué)檢測器，拆下工作電極，用超純水沖洗電極表面，也很奏效的，但對液相色譜技術(shù)不太熟練的技術(shù)員要小心操作，不宜反復(fù)這樣拆卸?；€噪音(規(guī)則的)產(chǎn)生基線噪音的原因有：在流動相、檢測器或泵中有空氣；漏液；流動相混合不完全；溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱)；在同一條線上有其他電子設(shè)備；泵振動。了避免基線噪音，在正式進(jìn)樣之前，需要對流動相脫氣；沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣；檢查管路接頭是否松動；泵是否漏液；是否有鹽析出和不正常的噪音，如有必要，更換泵密封；用手搖動使溶劑混合均勻或使用低粘度的溶劑減少差異或加上熱交換器；有其他電子設(shè)備時斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正；泵振動時在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。基線噪音(不規(guī)則的)漏液：檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封，檢查流通池是否漏液。流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成：檢查流動相的組成。流動相各溶劑不相溶：選擇互溶的流動相。檢測器/記錄儀電子元件的問題：斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正。系統(tǒng)內(nèi)有氣泡：用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng)；檢測器內(nèi)有氣泡，清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器。流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音):用硝酸清洗流通池;檢測器燈能量時不足更換燈;色譜柱填料流失或阻塞:更換色譜柱。流動相混合不均勻或混合器工作不正常:維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，不建議使用泵的混合裝置。保留時間保留時間漂移保留時間的漂移往往由柱老化引起，而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是由于不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失(例如通過水解)，色譜柱污染(由樣品或流動相所致)等。保留時間漂移的幾種最常見的原因和解決方法如下：色譜柱平衡如果觀察到保留時間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已經(jīng)平衡。在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱。通常平衡需要10～20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑(如離子對試劑)則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱。流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應(yīng)注意:水是很容易污染的流動相成分。固定相穩(wěn)定性固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的pH范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例如，硅膠基質(zhì)在pH4時水解穩(wěn)定性最好，水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定;長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定;烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。色譜柱污染保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是:流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)，如:配藥中的賦形劑，生化樣品(如血清)中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加，可以通過使用固相提取(SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響，避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設(shè)計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解，DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護(hù)柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。流動相組成流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等，應(yīng)防止流動相由于蒸發(fā)、反應(yīng)等等原因造成的變化。疏水坍塌當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌，此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進(jìn)行平衡。由是色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱(如WatersSymmetryShieldRP色譜柱)或非端基封口的色譜柱(如WatersResolve色譜柱)也可避免發(fā)生坍塌。保留時間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個重要標(biāo)志，同一種東西，兩次的保留時間相差不要超過15s，超過了半分鐘可看做保留時間漂移，就無法進(jìn)行定性，你要考慮以下原因：溫控不當(dāng)：調(diào)好柱溫，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱。流動相比例變化：檢查四元泵的比例閥是否有故障色譜柱沒有平衡：在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱流速變化：重新設(shè)定流速泵中有氣泡：從泵中除去氣泡流量變化：在正確使用流速與流動相的前提下檢查泵是否存在問題，比如漏液與在線混合的準(zhǔn)確性。流動相的問題：使用預(yù)混合則要注意每次配液的準(zhǔn)確性，精密度與PH的變化。有可能是流動相被污染或加入的添加劑對被測組分的干擾。色譜柱被污染：正/反相沖洗色譜柱或更換新色譜柱。梯度滯后時間設(shè)置不正確：檢查泵和流路系統(tǒng)維護(hù)記錄，確定很多系統(tǒng)最后使用之前有無調(diào)整。如有變化，重新計算新的梯度滯后體積。色譜柱使用問題：不同的色譜柱尺寸與填料對同一物質(zhì)的保留時間是不同的。同一批樣品的分析最好使用同一色譜柱。系統(tǒng)不平衡：應(yīng)該用充足的時間來平衡整個系統(tǒng)，特別在色譜柱第一次使用離子對試劑時，要有充足時間和流動相體積來平衡色譜柱。每次開機(jī)使用時平衡時間至少為0.5～1h，在改變流動相時也需要0.5h來重新平衡柱子。保留時間波動保留時間有的縮短，有的延長，有的上下波動，保留時間波動的主要原因：色譜柱溫度范圍控制的不好，溫度波動太大；流動相當(dāng)中組分發(fā)生變化；色譜柱沒有平衡；流動相流速發(fā)生變化；泵中有氣泡；流動相選擇不恰當(dāng)?shù)?。解決辦法：嚴(yán)格控制柱子的溫度，室內(nèi)溫度保持恒定，上下波動二度為宜；流動相的組