DB37T 3112-2018 豬偽狂犬病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

ICS65.020.30DB37DB37/T3112—2018豬偽狂犬病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T3112—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：李俊、時(shí)建立、彭喆、吳曉燕、張玲玲、鄭書(shū)軒、徐紹建、孫文博、于江、叢曉燕、韓紅、吳家強(qiáng)、杜以軍、陳蕾、陳智、劉暢。1DB37/T3112—2018豬偽狂犬病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬偽狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)檢測(cè)技術(shù)的操作步驟。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬偽狂犬病毒的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)與定義3.13.2嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶。3.33.4無(wú)毒型核酸染色劑。4材料及設(shè)備4.1主要儀器設(shè)備4.1.1微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭。4.1.220000r/min低溫高速離心機(jī)。2DB37/T3112—204.1.3電熱恒溫水槽。4.1.4穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀。4.1.5水平電泳槽。4.1.6凝膠成像系統(tǒng)。4.1.7紫外透射反射分析儀。4.1.8電磁爐。4.1.9燒杯(1000mL)。4.1.10電子天平精度為：0.001g。4.2主要試劑或材料4.2.15mol/LBetaine溶液：配制見(jiàn)附錄A.1。4.2.2BstDNAPolymerase(8U/μL)。4.2.3SYBRGreenI核酸染料。4.2.52%瓊脂糖電泳液：配制見(jiàn)附錄A.3。4.2.64SGreenPlusNucleicAcidStain。4.2.7DNAMarker2000。4.2.9超純水：符合GB/T6682,三級(jí)。F3:5'-ACGAGCCCCGCTTCCA-3'。B3:5'-AGATGCAGGGCTCGTACA-3'。5檢測(cè)步驟5.1樣品采集與處理采集血清或淋巴結(jié)、肝臟、肺臟、脾臟和腎臟等臟器。5.2樣品處理5.2.1血清直接用于DNA提取。5.2.2淋巴結(jié)、肝臟、肺臟、脾臟和腎臟等臟器各1g剪碎放于滅菌的研磨器中磨碎，用生理鹽水1:5倍稀釋?zhuān)乙悍磸?fù)凍融3次，5000r/min離心15min,取上清液-20℃保存?zhèn)溆谩?.3病毒DNA的提取水浴2h～3h。5.3.2加入200μLTris飽和酚，混勻，4℃12000r/min離心15min。5.3.3取上清液500μL,加入200μLTris飽和酚和200μL三氯甲烷，4℃12000r/min離心3DB37/T3112—20185.3.5取上清液300μL,加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃靜置20min,4℃12000r/min離心15min。5.3.6棄上清液，加入1mL70%的乙醇沖洗沉淀表面及管壁，棄乙醇，晾干。5.4.1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系配制，按表1中1～8的循序配制。體系組成體系含量110×ThermoPol2dNTP混合液(10mmol/L)34BIP/FIP(50μmol/L)5Betaine(5mol/L)6DNA7BstDNAPolymerase(8U/μL)8超純水5.4.2LAMP程序設(shè)定表2LAMP反應(yīng)程序設(shè)定溫度時(shí)間160min25.5.12%瓊脂糖凝膠板的制備(見(jiàn)附錄A.3)。5.5.2加樣混合，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠孔中，以DNA保持穩(wěn)定電壓80V,電泳20min,觀察結(jié)果。在試驗(yàn)成立條件下，出現(xiàn)瀑布樣條帶泳道的樣品判為陽(yáng)性(說(shuō)明樣品中含有豬偽狂犬病毒),不出現(xiàn)瀑布樣條帶泳道的樣品為陰性(參見(jiàn)附錄A.5)。4DB37/T3112—206.2可視化結(jié)果判定6.2.1LAMP反應(yīng)體系中加入1μLSYBRGreenI核酸染料，混勻(加深觀察顏色),陽(yáng)性反應(yīng)管內(nèi)液體變?yōu)辄S色，陰性反應(yīng)管不發(fā)生顏色變化，為橘紅色(參見(jiàn)附錄A.6)。6.2.2反應(yīng)管置于紫外透射反射分析儀下，陽(yáng)性反應(yīng)管發(fā)出明亮的黃綠色熒光，陰性反應(yīng)管不顯現(xiàn)熒光(參見(jiàn)附錄A.7)。5DB37/T3112—2018(規(guī)范性附錄)試劑的配制滅菌超純水2.5mL。A.20.5×TBE緩沖液Na2EDTA.2H20硼酸55g。滅菌超純水定容至1L,配成10×TBE緩沖液。A.32%瓊脂糖電泳液瓊脂糖0.5×TBE緩沖液滅菌超純水定容至mL,加滅菌水475