常見化學(xué)發(fā)光免疫分析關(guān)鍵技術(shù)比較

常用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)比較

1、化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay,CLIA）,

英音：[,kemi,lju:mi'nesans][,imju:n0uo*sei]

是將具備高敏捷度化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性免疫反映相結(jié)

合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥

物等檢測分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時(shí)間

辨別熒光免疫分析之后發(fā)展起來一項(xiàng)最新免疫測定技術(shù)。

CLIA是將具備高敏捷度化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性免疫反映

相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素

和藥物等檢測分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和

時(shí)間辨別熒光免疫分析之后發(fā)展起來一項(xiàng)最新免疫測定技術(shù)。

1.1、化學(xué)發(fā)光免疫分析原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析包括兩個(gè)某些，即免疫反映系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分

析系統(tǒng)?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是運(yùn)用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑催化和氧化

劑氧化，形成一種激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定基態(tài)

時(shí)，同步發(fā)射出光子（hv）,運(yùn)用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產(chǎn)額。

免疫反映系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)（在反映劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體）直

接標(biāo)記在抗原（化學(xué)發(fā)光免疫分析）或抗體（免疫化學(xué)發(fā)光分析）上，

或酶作用于發(fā)光底物。

1.2、化學(xué)發(fā)光免疫分析類型

化學(xué)發(fā)光免疫分析法以標(biāo)記辦法不同而分為兩種：

⑴化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法；

⑵酶標(biāo)記、以化學(xué)發(fā)光底物作信號試劑化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法

1.2.1化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA),是用化

學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體免疫分析辦法。慣用于標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物

質(zhì)有口丫咤酯類化合物?acridiniumester(AE),是有效發(fā)光標(biāo)記物，其

通過起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH-HzCh)作用而發(fā)光，強(qiáng)烈直接發(fā)光在一秒

鐘內(nèi)完畢，為迅速閃爍發(fā)光?？谘具艴プ鳛闃?biāo)記物用于免疫分析，其化

學(xué)反映簡樸、迅速、不必催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分

子抗原則采用夾心法，非特異性結(jié)合少，本底低；與大分子結(jié)合不會

減小所產(chǎn)生光量，從而增長敏捷度。

1.2.2化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

從標(biāo)記免疫分析角度，化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescent

enzymeimmunoassay,CLEIA),應(yīng)屬酶免疫分析，只是酶反映底物

是發(fā)光劑，操作環(huán)節(jié)與酶免分析完全相似：以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如

醮標(biāo)記抗原或抗體)進(jìn)行免疫反映，免疫反映復(fù)合物上酶再作用于發(fā)

光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進(jìn)行發(fā)光測定。

當(dāng)前慣用標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP),它

們有各自發(fā)光底物。

12.2.1HRP標(biāo)記CLEIA

慣用底物為魯米諾(3?氨基鄰苯二甲酰腫,luminol),或其衍生物

如異魯米諾(4.氨基鄰苯二甲酰脫)，是一類重要發(fā)光試劑。其構(gòu)造如

圖4所示。魯米諾氧化反映在堿性緩沖液中進(jìn)行，在過氧化物酶及

活性氧［過氧化陰離子(0,，單線態(tài)氧(102),羥自由基(0H?),

過氧化氫(H2O2)］存在下，生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，

其波長為425nm。

初期用魯米諾直接標(biāo)記抗原(或抗體)，但標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度減少

而使敏捷度受到影響。近來用過氧化物酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行免疫反映后

運(yùn)用魯米諾作為發(fā)光底物，在過氧化物酶和起動(dòng)發(fā)光試劑(N

aOH-H2O2)作用下，魯米諾發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度依賴于防免疫反映物中酶

濃度。KodakAmerliteTM半自動(dòng)分析系統(tǒng)就是運(yùn)用這一體系專門設(shè)

計(jì)。

1.2.2.2增強(qiáng)發(fā)光酶免疫分析(enhancedluminescenceenzyme

immunoassay,ELEIA)

在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑，如對2碘苯酚等，以增強(qiáng)發(fā)光信

號，并在較長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，便于重復(fù)測量，從而提高分析敏捷度

和精確性。在全自動(dòng)分析儀上，還可通過計(jì)算機(jī)嚴(yán)密控制，進(jìn)行自動(dòng)

操作，如加試劑，混合，溫育，洗滌，加發(fā)光試劑，發(fā)光計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)

解決，繪制原則曲線，直至完畢病人血清樣品分析并打印出成果。

AmerliteTM發(fā)光增強(qiáng)酶免分析系統(tǒng)用熒光素、噬唾等增強(qiáng)劑，其發(fā)

光時(shí)間可持續(xù)長達(dá)20min,試劑盒有甲狀腺功能檢測促甲狀腺素、三

碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、游離甲狀腺素，與

性激素關(guān)于有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎

蛋白、雌二醇、睪酮，以及其她方面如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。

1.2.2.3ALP標(biāo)記CLEIA

所用發(fā)光底物為環(huán)1，2.二氧乙烷衍生物,，用于化學(xué)發(fā)光酎免分析

底物而設(shè)計(jì)分子構(gòu)造中包括起穩(wěn)定作用金剛烷基，其分子中發(fā)光基團(tuán)

為芳香基團(tuán)和酶作用基團(tuán)，在酶及起動(dòng)發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)

光。最常使用底物AMPPD3-[2-spiroadamatane]-4-methoxy

-4-[3-phosphoryloxy]-phenyl-1,2-dioxetane）Dioxetane中文名為：3-（2-

螺旋金剛烷）?4.甲氧基?4?（3?磷氧酰）?苯基-12二氧環(huán)乙烷。在堿性磷

酸酶（ALP）作用下，磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一種磷酸基，得到一種

中檔穩(wěn)定中間體AMPD（半壽期為2-30min）,此中間體經(jīng)分子內(nèi)電

子轉(zhuǎn)移裂解為一分子金剛烷酮和一分子處在激發(fā)態(tài)間氧苯甲酸甲酯

陰離子，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生470nm光，可持續(xù)幾十分鐘（如圖5）。

AMPPD為磷酸酯酶直接化學(xué)發(fā)光底物，可用來檢測堿性磷酸酯酶或

酶和抗體、核酸探針及其他配基結(jié)合物?？蓹z測到堿性磷酸酯酶濃度

為10?15mol/Lo

美國DPC公司Immulite全自動(dòng)酶放大發(fā)光免疫分析儀，以堿性

磷酸酶為標(biāo)記物，以金剛烷作發(fā)光底物，測定敏捷度相稱于10-

21mol/mL酶，采用聚苯乙烯珠作載體，其檢測水平已能達(dá)到10-

12g/mLo

AMPPD是一種生物化學(xué)領(lǐng)域中最新超敏捷堿性磷酸酶底物，其

特點(diǎn)：反映速度快，在很短時(shí)間內(nèi)提供對的可靠成果。在它分子構(gòu)造

中有兩個(gè)重要某些，一種是聯(lián)接苯環(huán)和金剛烷二氧四節(jié)環(huán)，它可以斷

裂并發(fā)射光子；另一種是磷酸根基團(tuán)，它維持著整個(gè)分子構(gòu)造穩(wěn)定。

在普通狀況下，這種化合物很穩(wěn)定。但是當(dāng)有堿性磷酸酶存在時(shí)，

DioxetanePhosphate作為醐底物會在醐催化一脫去磷酸根基團(tuán)，形成

一種不穩(wěn)定中間體。這個(gè)中間體隨后自行分解（二氧四節(jié)環(huán)斷裂），

同步發(fā)射光子。

該試劑采用微粒子化學(xué)發(fā)光技術(shù)，采用最新磁性微粒，用以包被

抗體。用堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記抗原（抗體）。通過普通抗原抗體

反映，堿性磷酸酶結(jié)合在微粒子上，堿性磷酸酶結(jié)合量同病人血清中

待測物質(zhì)成比例。通過洗滌（反映管兩邊有磁場，磁性微粒包被抗原

抗體結(jié)合物被吸附在管子兩邊，別的游離某些被抽吸掉），最后加入

發(fā)光底物DioxetanePhosphate,5分鐘后，儀器通過光電倍增管檢測

反映發(fā)光強(qiáng)度。

AMPPD是堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物，在適當(dāng)緩沖液中，隨著酶

催化水解作用，AMPPD分解成AMP?D,后者發(fā)出強(qiáng)度很高光信號,

其發(fā)光速度取決于堿磷酶濃度。當(dāng)堿磷酶偶合到雜交探針時(shí)，便可以

通過此系統(tǒng)檢測到雜交分子存在量。

2微粒體發(fā)光免疫分析

微粒體發(fā)光免疫分析（microparticleluminescenceenzyme

immunoassay,MLEIA），該免疫分析技術(shù)有兩種辦法：一種是小分子抗

原物質(zhì)測定采用競爭法。另一種是大分子抗原物質(zhì)測定采用雙抗體夾

心法。該儀器所用固相磁粉顆粒極微小，其直徑僅1.0um,這樣大

大增長了包被表面積，增長抗原或抗體吸附量，使反映速度加快，也

使清洗和分離更簡便，從而減少污染，減少交叉污染概率。反映中使

用堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記抗原或抗體，作用于其底物二氧乙烷磷酸

酯，由其在激發(fā)態(tài)與基態(tài)動(dòng)力學(xué)變化中發(fā)生發(fā)光反映。

2.1＞競爭反映

其原理是：用過量包被磁顆?？贵w，與待測抗原和定量標(biāo)記口丫陡

酯抗原同步加入反映杯溫育，其免疫反映結(jié)合形式有兩種，一是標(biāo)記

抗原與抗體結(jié)合成復(fù)合物；二是測定抗原與抗體結(jié)合形式。如受檢標(biāo)

本中具有待測抗原，則與標(biāo)記抗原以同樣機(jī)會與磁顆粒包被抗體結(jié)

合，競爭性地占去了我咤酯標(biāo)記抗原與磁顆粒包被抗體結(jié)合機(jī)會，使

口丫咤酯標(biāo)記抗原與磁顆粒包被抗體結(jié)合量減少。由于磁顆粒包被抗體

是過量，足以與待測抗原結(jié)合。

2.2、雙抗體夾心法：

其原理是：標(biāo)記抗體與被測抗原同步與包被抗體結(jié)合成一種反映

形式，即包被抗體■測定抗原?發(fā)光抗體復(fù)合物。詳細(xì)講是以順磁性微

珠作為載體包被抗體，運(yùn)用磁性微珠能被磁場吸引，在磁場作用下發(fā)

生力學(xué)移動(dòng)特性，迅速捕獲到被測抗原，當(dāng)加入標(biāo)本后，標(biāo)本中抗原

與磁性抗體形成復(fù)合物，在磁力作用下，協(xié)助該復(fù)合物迅速地與其她

非特異性物質(zhì)分離，使抗原■抗體結(jié)合反映時(shí)間縮短，測定期間減少,

減少了交叉污染幾率，此時(shí)再加入堿性磷酸酶標(biāo)記第二抗體，形成磁

珠包被抗體■抗原■酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌去掉未結(jié)合抗體后，加

入ALP發(fā)光底物環(huán)1,2.二氧乙烷衍生物AMPPD。

AMPPD被復(fù)合物上ALP催化，迅速地去磷酸基團(tuán)，生成不穩(wěn)定

中間體AMPDoAMPD迅速分解，從高能激發(fā)態(tài)回到低能量穩(wěn)定態(tài)

時(shí)，持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)射出光子（hv）,發(fā)射光所釋放光子能量被光量子

閱讀系統(tǒng)記錄，通過計(jì)算機(jī)解決系統(tǒng)將光能量強(qiáng)度在原則曲線上轉(zhuǎn)換

為待測抗原濃度，并報(bào)告成果。其檢測水平可達(dá)pg/ml水平，重復(fù)性

好。

3、電化學(xué)發(fā)光免疫分析（Electrochemiluminescenceimmunoassay,

ECLIA）

ECLIA是繼放射免疫、酗免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測定

后來新一代標(biāo)記免疫測定技術(shù)，是電化學(xué)發(fā)光（ECL）和免疫測定相

結(jié)合產(chǎn)物。它標(biāo)記物發(fā)光原理與普通化學(xué)發(fā)光（CLA）不同，是一

種在電極表面由電化學(xué)引起特異性化學(xué)發(fā)光反映，事實(shí)上涉及了電化

學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個(gè)過程。ECL與CLA差別在于ECLA是電啟動(dòng)發(fā)光

反映，而CLA是通過化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反映。ECLA不但可以應(yīng)

用于所有免疫測定，并且還可用于DNA/RNA探針檢測。

其檢測原理（以TSH檢測為例）：第一步：結(jié)合了活化三聯(lián)此咤

釘衍生物即［Ru（bpy）3］2++N羥基琥珀酰胺酯（NHS）TSH抗體和結(jié)合

了生物素TSH抗體與待測血清同步加入一種反映杯中孵育9分鐘。

第二步：將被鏈霉親和素包被磁珠加入反映杯中，再次孵育9分

鐘，使生物素通過與親和素結(jié)合將磁珠、TSH抗體連接為一體，形成

雙抗體夾心法。

下一步，蠕動(dòng)泵將形成［Ru（bpy）3p+■抗體.抗原.抗體.磁珠復(fù)合體

吸入流動(dòng)測量室，此時(shí)，磁珠被工作電極下面磁鐵吸附于電極表面。

同步，游離TSH抗體(與生物素結(jié)合和與［Ru(bpy)3］2+結(jié)合抗體)也

被吸出測量室。

緊接著，蠕動(dòng)泵加入含三丙胺(TPA)緩沖液，同步電極加電壓,

啟動(dòng)ECL反映過程。發(fā)光劑［Ru(bpy)3產(chǎn)和電子供體TPA在陽極表

面可同步各失去一種電子而發(fā)生氧化反映，使二價(jià)［Ru(bpy)3］2+被氧化

成三價(jià)，后者是一種強(qiáng)氧化劑；另一方面，TPA被氧化成陽離子自

由基TPA+?,后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去一種質(zhì)子(H+),形成自

由基TPA?，這是一種很強(qiáng)還原劑，可將一種電子給三價(jià)［Ru(bpy)3p+,

使其形成激發(fā)態(tài)［Ru(bpy)T+,而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。

激發(fā)態(tài)［Ru(bpy)3p+通過熒光機(jī)制衰減，發(fā)射出一種波長620nm光子,

重新生成基態(tài)［Ru(bpy)3p。該過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生

許多光子，光電倍增管檢測光強(qiáng)度，光強(qiáng)度與［Ru(bpy)3］2+濃度呈線

性關(guān)系，故可測出待測抗原含量。

最后，終結(jié)電壓，移開磁珠，加入清洗液沖洗流動(dòng)測量室，準(zhǔn)備

下一種樣品測定。

4、時(shí)間辨別熒光免疫分析(timeresolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)

TRFIA以錮系元素作為標(biāo)記物所建立免疫測定技術(shù)。因錮系元素

(如Eu3+)所發(fā)射熒光壽命長，在測定特異性熒光時(shí)，可通過延遲檢測

時(shí)間而將標(biāo)本或環(huán)境中非特異熒光扣除，使其具備良好信噪比。

時(shí)間辨別熒光免疫測定(TRFIA)是一種非同位素免疫分析技術(shù),

它用錮系元素標(biāo)記抗原或抗體，依照錮系元素螯合物發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)

間辨別技術(shù)測量熒光，同步檢測波長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號辨別，

可有效地排除非特異熒光干擾，極大地提高了分析敏捷度。

在生物流體和血清中許多復(fù)合物和蛋白自身就可以發(fā)熒光，因而

使用老式發(fā)色團(tuán)進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測敏捷度就會嚴(yán)重下降。大某些背景

熒光信號是短時(shí)存在，因而將長衰減壽命標(biāo)記物與時(shí)間辨別熒光技術(shù)

相結(jié)合，就可以使瞬時(shí)熒光干擾減到最小化。

時(shí)間辨別熒光分析法（TRFIA）事實(shí)上是在熒光分析（FIA）基

本上發(fā)展起來，它是一種特殊熒光分析。熒光分析運(yùn)用了熒光波長與

其激發(fā)波長巨大差別克服了普通紫外?可見分光分析法中雜色光影

響，同步，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發(fā)光不在同始

終線上，激發(fā)光不能直接到達(dá)光電接受器，從而大幅度地提高了光學(xué)

分析敏捷度。但是，當(dāng)進(jìn)行超微量分析時(shí)候，激發(fā)光雜散光影響就顯

得嚴(yán)重了。因而，解決激發(fā)光雜散光影響成了提高敏捷度瓶頸。

解決雜散光影響最佳辦法固然是測量時(shí)沒有激發(fā)光存在。但普通

熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。但是有非常

少稀土金屬（Eu、Tb、Sm>Dy）熒光壽命較長，可達(dá)l~2ms,可

以滿足測量規(guī)定，因而而產(chǎn)生了時(shí)間辨別熒光分析法，雖然用長效熒

光標(biāo)記物，在關(guān)閉激發(fā)光后再測定熒光強(qiáng)度分析辦法醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)收

集整頓。

平時(shí)慣用稀土金屬重要是Eu（鉆）和Tb（鍬），Eu熒光壽命1ms,

在水中不穩(wěn)定，但加入增強(qiáng)劑后可以克服；Tb熒光壽命1.6ms,水中

穩(wěn)定，但其熒光波長短、散射嚴(yán)重、能量大易使組分分解，因而從測

量辦法學(xué)上看Tb較好，但不合用于生物分析，故Eu最為慣用。

4.1、時(shí)間辨別信號原理

普通物質(zhì)熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，在選取熒光物質(zhì)作

為標(biāo)記物時(shí)，必