第八節(jié) 基因治療與基因診斷課件

2.8基因治療第八節(jié)基因治療與基因診斷2.8基因治療一、基因治療的概念◆基因治療（genetherapy）——就是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能基因，以糾正或補(bǔ)償其基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的。2.8基因治療NakedDNATargetCellTherapeuticProteinAAVRetrovirus/LentivirusAdenovirusNucleusGeneTherapyPrinciples2.8基因治療原位修復(fù)(基因修復(fù)）：對(duì)有缺陷的基因在原來位置上進(jìn)行修復(fù)，使該基因恢復(fù)正常基因替代療法：治療策略是切除發(fā)生缺陷的基因，再轉(zhuǎn)入有功能的正?；蛟鰪?qiáng)：將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物可以補(bǔ)償缺陷細(xì)胞的功能基因抑制：導(dǎo)入外源基因以抑制原有的基因，目的在于阻斷有害基因的表達(dá)二、基因治療的策略2.8基因治療基因治療的前景分析基因治療：降低成本理論上所有治療基因（包括非分泌蛋白）均可開展基因治療基因治療：技術(shù)上難度大，有效性和安全性要求高基因治療：僅10余年歷史，技術(shù)不夠成熟，風(fēng)險(xiǎn)大2.8基因治療三、基因治療的兩大途徑2.8基因治療1．體細(xì)胞基因治療：把外源基因?qū)牖颊叩捏w細(xì)胞，以治療或預(yù)防基因接納者個(gè)人的疾病，只有特定的個(gè)體受益，但不能遺傳給后代。

2．種系細(xì)胞的基因治療：在生殖細(xì)胞（精子、卵子或未分化的受精卵）中引入正?；蚧蛐迯?fù)缺陷基因以校正遺傳缺陷。引入的外源基因（整合到基因組）能遺傳給后代。優(yōu)點(diǎn)：目的基因轉(zhuǎn)移到機(jī)體的所有組織并遺傳給后代。目前尚未開展，一是涉及倫理學(xué)問題；二是技術(shù)困難（診斷困難、引起新的插入突變的危險(xiǎn)）

2.8基因治療又稱間接體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，基本途徑是：個(gè)體供者

組織或細(xì)胞移植物

組織培養(yǎng)治療基因或標(biāo)記基因

培養(yǎng)細(xì)胞選擇或富集轉(zhuǎn)基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或受試病人的靶器官

1.通過回體（exvivo）基因轉(zhuǎn)移的治療途徑2.8基因治療又稱直接體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，將插入目的基因的表達(dá)載體直接導(dǎo)入體內(nèi)的方法。基本途徑是：含治療基因表達(dá)載體直接注射/與介質(zhì)結(jié)合后直接注射或用基因槍導(dǎo)入體內(nèi)包裝細(xì)胞系中包裝好的復(fù)制缺陷型病毒顆粒優(yōu)點(diǎn)：簡便省時(shí)省力，能很快觀察到外源基因的表達(dá)及作用缺點(diǎn)：DNA在體內(nèi)不易進(jìn)入細(xì)胞，易被降解，以病毒顆粒的形式導(dǎo)入人體則易引起免疫反應(yīng)和被補(bǔ)體滅活。2.通過體內(nèi)（invivo）基因轉(zhuǎn)移的途徑2.8基因治療四、基因轉(zhuǎn)移的方法病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體單純皰疹病毒載體非生物學(xué)方法直接注射脂質(zhì)體受體介導(dǎo)2.8基因治療（一）基因治療的病毒載體應(yīng)該具有的基本條件：攜帶外源基因并能組裝成病毒顆粒介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)對(duì)機(jī)體沒有致病能力2.8基因治療充分了解載體病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能（編碼區(qū)/非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白/非結(jié)構(gòu)蛋白、必須基因/非必須基因、包裝容量等）外源基因插入病毒基因組的非必須區(qū)致病基因（裂解細(xì)胞、癌基因使細(xì)胞轉(zhuǎn)化）刪除插入外源基因長度受限刪除非必須基因/必須基因（由輔助病毒或宿主細(xì)胞提供該基因的功能）病毒載體的產(chǎn)生2.8基因治療◆反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus,RV)載體優(yōu)點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)移的效率高，細(xì)胞宿主范圍較廣泛，DNA整合效率高于其它病毒載體等。缺點(diǎn)：只感染分裂狀態(tài)的細(xì)胞，載體容量?。ā?kb），目的基因在未分化的細(xì)胞中常丟失，隨機(jī)整合潛在致癌的危險(xiǎn)。2.8基因治療優(yōu)點(diǎn)：安全，不整合到染色體上不需要宿主細(xì)胞的分裂增殖就能進(jìn)入細(xì)胞缺點(diǎn)：免疫原性較強(qiáng)不能整合到宿主細(xì)胞基因組使得外源基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間有限插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。

◆腺病毒(AV)載體2.8基因治療優(yōu)點(diǎn)：嗜神經(jīng)組織能插入較長外源基因（20kb或略長些缺點(diǎn)：較大的基因組使得遺傳操作較難進(jìn)行不整合到宿主細(xì)胞基因組，表達(dá)持續(xù)的時(shí)間受限包含大量功能基因，安全水平尚待進(jìn)一步觀察◆皰疹病毒（HSV）載體2.8基因治療

優(yōu)點(diǎn)：安全，痘病毒在人類歷史上已經(jīng)廣泛應(yīng)用外源基因的容量可達(dá)30kb適用廣泛的細(xì)胞型（可感染非分裂的細(xì)胞）缺點(diǎn)：不整合入細(xì)胞基因組，故外源基因表達(dá)的時(shí)間不能持久載體過大，受免疫系統(tǒng)的影響也較大?！舳徊《荆≒oxvirus,PV）載體2.8基因治療（二）非病毒載體1.裸DNA2.脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物3.多聚物/DNA復(fù)合物4.其它方法2.8基因治療1.裸DNA方法：直接注射或基因槍轟擊溶液類型對(duì)基因表達(dá)有影響：重組DNA可貯存于5%-30%的蔗糖溶液中也可用生理鹽水或PBS2.8基因治療2.脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物形成高效包裝DNA的人造膜，與細(xì)胞膜極為相似。形成脂質(zhì)雙層包圍水溶液的脂質(zhì)微球，與細(xì)胞融合后被細(xì)胞內(nèi)吞。2.8基因治療無毒性和免疫原性可生物降解，不會(huì)在體內(nèi)堆積可制成球狀(0.03-50m)，包容大小不同的生物分子可帶有不同的電荷具有不同的膜脂流動(dòng)性、穩(wěn)定性、及溫度敏感性，能適應(yīng)不同的生理要求人工脂質(zhì)體膜具有如下特點(diǎn)2.8基因治療陽離子多聚體DNA帶負(fù)電細(xì)胞表面帶負(fù)電3.多聚物/DNA復(fù)合物2.8基因治療受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)磷酸鈣共沉淀法電穿孔法顯微注射法4.其它方法2.8基因治療

轉(zhuǎn)入功能基因（單基因遺傳病）血友病B薛京倫等用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將IX因子的cDNA至血友病B患者的皮膚成纖維細(xì)胞中，再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表達(dá)明顯增高，癥狀得到改善重癥綜合性免疫缺乏癥（SCID）五、基因治療的應(yīng)用2.8基因治療重癥綜合性免疫缺乏癥（SCID）腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥是常染色體隱性遺傳的致死性疾病，患者由于ADA缺乏導(dǎo)致脫苷腺氨酸增多，改變了甲基化能力，致使淋巴細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致免疫缺陷1990年，首次將ADA轉(zhuǎn)基因T淋巴細(xì)胞注射到人體骨髓組織（患有－－腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥的4歲兒童），治療SCID2.8基因治療基因治療SCID的過程2.8基因治療轉(zhuǎn)基因治療的問題與危險(xiǎn)性有效的目的基因過少；安全性:導(dǎo)入的基因缺乏調(diào)控手段；有效性和穩(wěn)定性：缺少高效和導(dǎo)向的載體系統(tǒng)；目前人們多重視分子水平的研究而忽略了整體研究，對(duì)整體宏觀水平缺乏了解。1999年9月17日，美國Arizona州18歲的青年格爾辛格在賓夕法尼亞大學(xué)人類基因治療研究所接受基因治療4天后不幸死亡，成為基因治療實(shí)施以來第1個(gè)直接死于這種試驗(yàn)的病人。

生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生2.8基因治療六、基因治療關(guān)鍵問題1.靶向性基因?qū)胂到y(tǒng)基因治療的關(guān)鍵問題是將治療基因送入特定得靶細(xì)胞，并在該細(xì)胞中得到高效表達(dá)；2.外源基因表達(dá)的可控性導(dǎo)入基因后無調(diào)控表達(dá)將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果。最理想的可控性是模擬人體內(nèi)基因本身的調(diào)控形式；3.治療基因過少

2.8基因治療2.8基因治療2.8基因治療2.8基因治療Fig.1.MapofrecombinantAd.RGD.mda-7andAd.RGD.pK7.mda-7adenovirusvectorsgenomesencodingmda-7.2.8基因治療Fig.2.FigureshowingtheenhancedtumorkillingeffectofgeneticallymodifiedAd.RGD.pK7.mda-7andAd.RGD.mda-7virusescomparedtounmodifiedAd.mda-7.2.8基因治療Fig.3.PBS(A)orcontrolvirusAd.GFPtreatedanimals(B),orAd.RGD.Pk7.GFPtreatedanimals2.8基因治療Fig.4.SignificantinhibitionoftumorgrowthandbloodyasciteswasshowninAd.mda-7treatedanimals(C)andAd.RGD.pK7.mda-7treatedanimals(E).2.8基因治療

基因治療在未來人類重大疾病的預(yù)防和治療上必將發(fā)揮越來越大的作用！2.8基因治療七、基因診斷（GeneDiagnosis）G到T一個(gè)堿基的改變，決定了一個(gè)人的命運(yùn)小皓珩出生23個(gè)月就出現(xiàn)皮疹、便血等病狀，患上了罕見的原發(fā)性免疫缺陷病。DNA序列分析，證實(shí)了小皓珩WAS蛋白基因的1388位核苷酸由G突變?yōu)門，使編碼谷氨酸的密碼GAG突變?yōu)榻K止密碼TAGWAS蛋白突變?yōu)闊o功能的WAS蛋白，導(dǎo)致患兒血小板減少，淋巴細(xì)胞形態(tài)和功能異常希望：WAS目前已經(jīng)可以用骨髓移植或干細(xì)胞移植根治通過從患者體內(nèi)提取樣本(DNA)用基因檢測(cè)方法來判斷患者是否有基因異?；驍y帶病原微生物的方法，就是基因診斷。生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生2.8基因治療傳統(tǒng)與基因診斷的比較

傳統(tǒng)的診斷望問

聽

觸——經(jīng)驗(yàn)化驗(yàn)/檢驗(yàn)——微生物、免疫學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)等對(duì)細(xì)胞、組織、酶、代謝物等檢測(cè)影像學(xué)—X線、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等特殊檢查—肌電/腦電/心電、骨密度等基因診斷應(yīng)用分子生物學(xué)方法：如PCR技術(shù)或PCR與分子雜交標(biāo)記主要應(yīng)用于先天遺傳性疾患（苯丙酮尿癥、血紅蛋白?。┖筇旎蛲蛔円鸬募膊。[瘤、糖尿病）病原生物的侵入（流感、肝炎、艾滋?。﹤€(gè)體識(shí)別、法醫(yī)物證生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生2.8基因治療感染性疾病檢測(cè)

利用PCR技術(shù)或PCR與分子雜交標(biāo)記相結(jié)合，可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出病原性物質(zhì)乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒結(jié)核桿菌和瘧原蟲的分型2.8基因治療公安司法系統(tǒng)——罪犯及受害人的身份識(shí)別及親子鑒定部隊(duì)——傷亡士兵的身份識(shí)別；印尼海嘯中死難人員身份識(shí)別保安——個(gè)人DNA身份證，用于人員識(shí)別個(gè)體識(shí)別14歲智障少女懷孕親子鑒定牽出70歲嫌犯

2.8基因治療作業(yè)：“英國研究人員2007年4月12日宣布，他們?cè)谑澜缟鲜状未_認(rèn)了一個(gè)與肥胖相關(guān)的等位基因，他們將之稱為FTO。這一研究成果發(fā)表在《科學(xué)》雜志上