ELISA 原理、方法及操作細(xì)節(jié)

ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)導(dǎo)師：馬學(xué)恩教授2021/6/271ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）Enzymeslinkedimmunosorbentassay2021/6/272簡(jiǎn)介1971年，瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann、荷蘭學(xué)者VanSchuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。ELISA就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)。2021/6/273酶和抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體與抗原免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無(wú)色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可用分光光度計(jì)加以測(cè)定。呈色反應(yīng)顯示了酶的存在，從而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。所以，這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克，甚至納米水平上對(duì)其進(jìn)行定量。2021/6/274基本原理先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原-抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量。2021/6/275方法類(lèi)型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類(lèi)型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法等。2021/6/2761，雙抗體夾心法：此法常用于檢測(cè)抗原它是利用待測(cè)抗原上的兩個(gè)抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)記抗體B結(jié)合，形成抗體A-待測(cè)抗原-酶標(biāo)抗體B復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原含量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類(lèi)型。2021/6/277抗體A待測(cè)抗原酶標(biāo)抗體包被物2021/6/2782，間接法測(cè)定抗體此法常用于測(cè)定抗體將已知抗原連接在固相載體上，待測(cè)抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測(cè)抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類(lèi)型。2021/6/279抗原待測(cè)抗體酶標(biāo)二抗包被物2021/6/27103，競(jìng)爭(zhēng)法此法既可用于檢測(cè)抗原和半抗原，也可以用于檢測(cè)抗體用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測(cè)的非標(biāo)記抗原（抗體）競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結(jié)合，待測(cè)抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測(cè)物含量成反比。2021/6/2711限量的的抗體酶標(biāo)抗原樣品抗原酶標(biāo)多于樣品顯色程度深樣品多于酶標(biāo)顯色程度淺顯色程度與待測(cè)物含量成反比包被物2021/6/27124，捕獲法（反向間接法）主要用于測(cè)定血清中某種抗體亞成分以目前最常用的IgM測(cè)定為例，因血清中針對(duì)某種抗原的特異性IgM和IgG同時(shí)存在，而后者可干擾IgM的測(cè)定。因此，先針對(duì)IgM的第二抗體(如羊抗人IgMμ鏈抗體）連接于固相載體，用以“捕獲”樣品中所有IgM；洗滌除去IgG等無(wú)關(guān)物質(zhì)，然后加入特異性抗原與待測(cè)IgM結(jié)合；再次加入抗原特異的酶標(biāo)抗體；最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物顯色后，即可對(duì)待IgM進(jìn)行定性和定量測(cè)定。2021/6/2713針對(duì)IgM的第二抗體待測(cè)物其中含有IgM和IgG特異性抗原與IgM結(jié)合酶標(biāo)抗體包被物IgG等無(wú)關(guān)物質(zhì)被洗脫2021/6/2714具體步驟

包被封閉加待測(cè)物加一抗，二抗，或抗原等顯色2021/6/2715包被

用包被液稀釋包被抗體至合適濃度，包被酶聯(lián)板（聚乙烯微量反應(yīng)板），每孔100μ。用保鮮膜包好，4℃過(guò)夜。如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好過(guò)夜。次日棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干。用PBST洗液，洗4~5次。每次在洗板機(jī)清洗酶聯(lián)板上震蕩2~3min后，在面巾紙上拍干后進(jìn)行下一次清洗或下一步。2021/6/2716包被液0.05MPH9.6磷酸鹽緩沖液Na2CO31.59g；NaHCO32.93g；加蒸餾水至1000ml2021/6/2717PBST洗液2000mlPBS+1ml

Tween-20PBS：NaCl8g；KCl0.2g；Na2HPO41.42g；KH2PO40.27g；加1000ml蒸餾水定容，調(diào)PH至7.42021/6/2718洗板機(jī)2021/6/27192021/6/27202021/6/2721封閉用封閉液封閉，每孔100μ。室溫下，在微量振蕩器上，封閉2h。棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干。用PBST洗液，洗4~5次。（同包被）用保鮮膜包好，4℃可保存一個(gè)月。2021/6/2722封閉液10%小牛血清

（1ml小牛血清加到9ml1×PBS中混勻）。

5%脫脂奶粉（用洗液稀釋?zhuān)?021/6/2723加標(biāo)準(zhǔn)樣及樣品

待測(cè)樣或標(biāo)準(zhǔn)一抗：用PBST洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔100μl，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器上孵育2小時(shí)。清洗。二抗：用PBST洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔100μl，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器上孵育1小時(shí)。清洗。2021/6/2724注意

抗體抗原反應(yīng)比較快，一般1~2個(gè)小時(shí)就達(dá)到峰值。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間容易出現(xiàn)非特異結(jié)合，但反應(yīng)時(shí)間不能少于1.5小時(shí)。二抗的使用濃度（一般，1：10000稀釋?zhuān)?yīng)當(dāng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，二抗的反應(yīng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，容易出現(xiàn)非特異反應(yīng)。一般，反應(yīng)40~60分即可。2021/6/2725OPD顯色臨用前取A液5.14ml，B液4.86ml加入OPD(鄰苯二胺，在-20℃中保存）0.0040g（約4小片），溶解后加入50μl的30%H2O2，配成顯色液。（OPD要充分混勻，否則容易出現(xiàn)個(gè)別孔顏色太深）顯色液每孔100μl。避光顯色15~20min。用2mol／LH2SO4終止反應(yīng)，每孔50μl2021/6/2726顯色液A液：0.2mol／LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O71.7g加水至1000mlB液：0.1mol／L檸檬酸檸檬酸19.2g檸檬酸，加水至1000ml2021/6/2727結(jié)果判定酶標(biāo)測(cè)定儀檢測(cè)（429nm），測(cè)定OD值：待測(cè)孔（P）與對(duì)照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽(yáng)性注意：要有陰性，陽(yáng)性對(duì)照。2021/6/27282021/6/2729應(yīng)用ELISA法由于測(cè)定靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便、酶標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定、易于自動(dòng)化、無(wú)反射性污染，且易與其他相關(guān)技術(shù)偶聯(lián)，使其成為目前應(yīng)用最廣泛而且發(fā)展最快的一種免疫測(cè)定技術(shù)。市場(chǎng)上符合質(zhì)量要求的商品試劑盒（提供有包裝好的固相載體、酶標(biāo)記物及其底物和洗滌液等全套試劑成分）和自動(dòng)或半自動(dòng)檢