DB21T 2592.3-2016 雞傳染性疾病檢測(cè)方法 第3部分：雞馬立克氏病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法　　

DB21DB21/T2592.3—2016雞傳染性疾病檢測(cè)方法第3部分：雞馬立克氏病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法DetectionmethodofchickeninfectiousdiseasePart3:Thetestingmethodofreal-timefluorescentPCRforchickenMarek'sdisease遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 5——雞傳染性法氏囊病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法——雞傳染性支氣管炎病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法——雞馬立克氏病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法本部分起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動(dòng)物1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic實(shí)時(shí)熒光PCR：實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timefluore4儀器與器材4.1.2高速離心機(jī)4.1.6微量移液器（最大量程為2μL，20μL，200μL，25.1DNAzol?Reagent：DNA抽提試劑，外觀為淡綠色，于4℃~8℃保存。5.575%乙醇：用無(wú)水乙醇和滅菌雙皮膚要選病變明顯部分的邊緣，采取少許放入1.5mL離心羽毛選病變明顯部分，用刀片刮取羽毛及根部的皮屑少許，放入1.5mL離心管將產(chǎn)生馬立克氏病毒蝕斑的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管采集的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免送到實(shí)驗(yàn)室。按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品生物3在樣本處理區(qū)進(jìn)行。在各設(shè)定的熒光PCR管或96孔板4Ct值>30.0，且出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)的樣本判定為可疑?？梢蓸颖具M(jìn)行雙孔重復(fù)試驗(yàn)，若任一孔或兩孔重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Ct值≤30.0并出現(xiàn)典型擴(kuò)增5A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）A.1.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱(chēng)取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H20）71.A.1.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱(chēng)取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H20）31.21g，先加適量去離子水溶A.1.3