DB21T 3241-2020 玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)操作技術(shù)規(guī)程　

1DB21TechnicalspecificationfordetectionofgeneticallymodifiedcomponentsinMaize遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布12玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)操作技術(shù)規(guī)程SN/T4835實(shí)驗(yàn)室生物廢棄3DNA提取試劑盒DNAExtractio4.2種子及其加工品4.2.1種子及其加工品抽樣時(shí)，按照指定區(qū)域隨機(jī)購(gòu)買產(chǎn)品即可，每份樣品抽取量不少于2Kg。4.2.2所需物品：抽樣工作單、潔凈無(wú)污染物的樣品袋等。4.2.3抽樣工作單根據(jù)實(shí)際情況，包含以下內(nèi)容：樣品名稱、樣品編號(hào)、商標(biāo)、型號(hào)規(guī)格、生產(chǎn)日期生產(chǎn)單位情況（單位名稱、通訊地址、聯(lián)系人、電話）、抽樣單位情況（單位名稱、聯(lián)系人、電話、通訊地址）、受檢人簽字、受檢單位負(fù)責(zé)人簽字、受檢單位（公章）、抽樣人簽字、抽樣單位（公章）、44.3.2根據(jù)實(shí)際需要，所需物品如下：GPS定位儀、采樣信息表、自封袋、離心管、離心管架、塑料滴管、小燒杯、剪刀、稱量紙、試紙條、?？h、鄉(xiāng)）、GPS信息、試紙條檢測(cè)參數(shù)及結(jié)果、抽樣日5.1所送樣品按照樣品接收所規(guī)定的要求執(zhí)行。玉米樣品不能達(dá)到規(guī)定數(shù)量或重量，則應(yīng)注明不能復(fù)檢。其它限量時(shí)需要的樣品數(shù)量可以按照農(nóng)業(yè)部6.3樣品處理的研磨過(guò)程需在負(fù)壓或局部負(fù)壓環(huán)境下“待檢、在檢和檢畢”。正樣和副樣應(yīng)妥善保管，用于復(fù)驗(yàn)和復(fù)檢。57.1試劑包括：DNA提取試劑盒、引物、PCR反應(yīng)體系相關(guān)試劑7.2每批試劑到貨后均需進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證可以使用已知的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性樣品，對(duì)新購(gòu)試劑進(jìn)行8.1.1DNA提取方法可以選用農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-4-2010中適合的方法進(jìn)行，也可以選用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的8.1.2樣品DNA的提取純度OD260/OD280值應(yīng)在1.7～2.0之間，超出范圍的應(yīng)重新進(jìn)行提取。提取好的DNA按照公式：加水量(μLDNA濃度ng/μL÷25-1）×吸取DNA量(μL稀釋至25ng/μL，置于8.2.1試紙條檢測(cè)可以按照GB/T19495.8轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)方法中的方法進(jìn)行。8.2.2商業(yè)化的試紙條在使用前需用已知轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性樣品進(jìn)行驗(yàn)證，合格后再使用。8.2.3葉片進(jìn)行試紙條檢測(cè)時(shí)，可先將葉片剪成小塊，裝入離心管中，加入適量純凈水，使用研磨棒8.3.2引物需按現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行8.3.3引物一般采用外協(xié)的方式進(jìn)行合成，應(yīng)保留委托方提供的引物合成的質(zhì)量記錄，即在每批引物8.4.1PCR擴(kuò)增體系的配制和DNA樣品加入應(yīng)在不8.4.3玉米樣品的PCR擴(kuò)增參數(shù)包括：CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar或pat基因和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)8.5.1根據(jù)選用參數(shù)的擴(kuò)增片段，選擇合適68.5.2配制的瓊脂糖凝膠濃度為2%，即每100mL電泳液中加入2g瓊脂8.5.4DNA向電泳的正極泳動(dòng)，點(diǎn)樣孔放置于負(fù)極方向。8.5.5電源控制在2V/cm～5V/cm9結(jié)果判定與復(fù)驗(yàn)9.1篩選因子檢測(cè)結(jié)果為陰性的，即可判定為轉(zhuǎn)基因陰性樣品。篩選因子檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)因9.2復(fù)驗(yàn)結(jié)果與初檢結(jié)果一致時(shí)，即可確認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果，并需進(jìn)一步確認(rèn)9.3復(fù)驗(yàn)結(jié)果與初檢結(jié)果不一致時(shí)，需取正樣進(jìn)行第三次復(fù)驗(yàn)，9.4根據(jù)篩選因子的陽(yáng)性結(jié)果，通過(guò)轉(zhuǎn)基因玉米的分子特征，選擇相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行確認(rèn)。常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因玉米的分子特征及對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因玉米品種態(tài)，樣品重量，樣品處理方法，樣品保管人，申請(qǐng)?zhí)幚頃r(shí)間，批準(zhǔn)人，備注等項(xiàng)目。10.2.2超過(guò)保留期的陰性玉米樣品，包括正樣和副樣，按照7進(jìn)行無(wú)害化處理之后按照SN/T4835實(shí)驗(yàn)室生物廢棄物管理要求進(jìn)行11.3在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，盡量避免使用EB（溴化乙錠）進(jìn)行染色，如必需使用時(shí)，應(yīng)將使用后的電泳液進(jìn)行活性炭吸附過(guò)濾，進(jìn)行無(wú)害化處理之后按照SN/T4835實(shí)驗(yàn)室生物廢棄物管理要求進(jìn)1CaMV35SNOSCaMV35SpatNOSP-CDPKcry1AbCaMV35SP-PPCcry1AbCaMV35SCaMV35SBarCaMV35SPractI/RuBiSCom-epspsNOSMON810CaMV35Scry1AbMON863CaMV35Scry3Bb1T-hspCaMV35SnptIINOSNK603eCaMV35SCp4-epspsNOSPractI/CTP2Cp4-epspsNOSCaMV35SpatCaMV35SUbiZm1cry1FORF25polyACaMV35SpatCaMV35SUbiZm1cry34Ab1PinIIP-peroxidasecry35Ab1pinIICaMV35SpatCaMV35SMON89034eCaMV35Scry1A.105Hsp17FMV35Scry2AbNOSCaMV35SNptIINOSMON88017CaMV35Scry3Bb1T-hspP-ract1/CTP2Cp4-epspsNOSMIR604Pmicry3ANOSUbiZm1mpiNOSMIR162ZmUbiIntvip3Aa19eCaMV35SZmUbiInt