DB21T 3120-2019 水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16S rRNA分子標記法

DB21Technicalspecificationforspeciesmoleculariden遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I1水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標記法本方法規(guī)定了水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16SrRNA分子標記法的相關術語試劑、儀器和設備，樣品采集、保存和前處理，DNA提取和檢測，序列擴增和測序，以及物種鑒定的本方法適用于水產(chǎn)動物物種分子鑒定COI、16SrRNAGB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗指利用分子生物學手段,對水產(chǎn)動物樣本（尤其適用于形態(tài)學特征相近、模糊或丟失的樣本）的分聚合酶鏈式反應polymerasechainreactio24標記方式比對，確定物種分類信息。本方法同時對COI和16SrRNA兩種分子標記條形碼進行分析，并在GenBank（/genbank）和BOLDSystem（）兩個數(shù)實驗僅使用分析純試劑，水應符合GB/T6682一級水要求?！?5%乙醇；——TE緩沖液（pH7.6100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0——Taq酶（5U/μL——10×PCR緩沖液（500mmol/LKCl；100mmol/LTris-Cl，pH8.3；15mmol/LMgCl2）；——溴化乙錠（10mg/mL）；）；5.2儀器和設備）；3樣本采集和后續(xù)實驗應在生物安全實驗室進行。選擇DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、腸道、積3mol/LNaAc和2.5倍體積無水乙醇，混勻，置于-27.1.412000rpm離心15min，棄上清。以分別于260nm和280nm波長下測定DNA的紫外吸收值。DNA濃度(μg/mL)=[A260/(0.020×L)]×稀釋4），），9物種鑒定9.1序列比對鑒定將COI基因序列在GenBank和BOLDSystem中進行核苷酸序列比對，將16SrRNA基因序列在GenBank——若出現(xiàn)2個及以上比對結(jié)果，則選取相似度高且結(jié)果一致的鑒定物種作為鑒——對于鑒定成功的樣本，記錄于《水產(chǎn)動物物種分子鑒定記錄表》9.2未檢出樣本未檢出樣本記錄于《未檢出水產(chǎn)動物分類記錄表5PCR擴增引物F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-F:5'-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3'R:5'-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-F:5'-ACAAATCAYAARGAYATYGG-R:5'-ACCAATCATAAAGATATTGF:5'-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-R:5'-GTAAATATATGRTGGGCTCF:5'-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-R:5'-GCTCGTGTRTCTACRTCCAF:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCF:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'R:5'-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-F:5'-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3'R:5'-TGGTGGGCTCATACAATAAAGF:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC綱和頭足F:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-R:5'-TCCATAGGGTCTTCTCGF:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-R:5'-TCCATAGGGTCTTATCGF:5'-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-R:5'-TCCATAGGGTCTTTTCG6鑒定人；地點123456789采樣人記錄人7鑒定人；地點123456789采樣人