第9章 催化策略(劉建華)

BiochemistrySixthEditionChapter9:CatalyticStrategies(催化(cuīhuà)策略）Copyright?2007byW.H.FreemanandCompany

Berg?Tymoczko?Stryer共七十八頁(yè)國(guó)際象棋和酶都使用策略，國(guó)際象棋通過(guò)比賽發(fā)展策略，而酶則通過(guò)進(jìn)化建立酶促反應(yīng)機(jī)制。右邊是能夠酶切肽鍵(tàijiàn)的活性位點(diǎn)，由三個(gè)氨基酸殘基（化學(xué)鍵是白色）構(gòu)成。用黑色化學(xué)鍵表示的底物分子如同左邊比賽中已經(jīng)落入圈套的國(guó)王，面臨被裂解的命運(yùn)。共七十八頁(yè)酶催化效率高、特異性強(qiáng)、條件溫和。這些特征的基礎(chǔ)是什么？介紹(jièshào)四類(lèi)酶促反應(yīng)的機(jī)制：絲氨酸蛋白酶、碳酸脫水酶、限制性核酸內(nèi)切酶、和核苷單磷酸激酶。前三類(lèi)將水分子加成到底物分子上，第四類(lèi)避免水分子的加成。經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究（包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定、定點(diǎn)突變），發(fā)現(xiàn)：酶的催化機(jī)制基本策略是結(jié)合能、誘導(dǎo)匹配、和一些特殊的催化策略，協(xié)助底物形成轉(zhuǎn)化態(tài)共七十八頁(yè)每類(lèi)酶的催化機(jī)制能解決各種化學(xué)反應(yīng)(huàxuéfǎnyìng)所面臨的問(wèn)題。蛋白酶：將缺乏催化劑和pH7.0幾乎不發(fā)生的反應(yīng)(蛋白質(zhì)水解）進(jìn)行下去。碳酸脫水酶：將化學(xué)反應(yīng)加速到能夠與其他快速生理過(guò)程融合的水平。限制性內(nèi)切酶：實(shí)現(xiàn)酶切反應(yīng)的高度特異性。NMP激酶：把磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移給另一個(gè)核苷酸（而不會(huì)轉(zhuǎn)移到水分子）。共七十八頁(yè)酶采用的幾個(gè)基本的催化原則底物與酶結(jié)合啟動(dòng)催化。結(jié)合能是酶和底物之間形成大量弱相互作用所釋放的自由能。這種結(jié)合能既可建立底物特異性，又能增加酶促效率。當(dāng)?shù)孜镛D(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化態(tài)，底物與酶之間完全互補(bǔ)。因此底物和酶之間的相互作用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化態(tài)，從而降低(jiàngdī)反應(yīng)的活化自由能。結(jié)合能對(duì)底物和酶分子的結(jié)構(gòu)變化都有促進(jìn)作用，使它們相互間匹配度更高（誘導(dǎo)匹配），有助于催化反應(yīng)。共七十八頁(yè)酶通常采用(cǎiyòng)下列一種或幾種策略催化特定化學(xué)反應(yīng)。共價(jià)催化。共價(jià)催化的活性位點(diǎn)有活潑基團(tuán)，通常是很強(qiáng)的親核基團(tuán)。在酶促過(guò)程中親核基團(tuán)能暫時(shí)性共價(jià)連接底物。胰凝乳蛋白酶就采用這種策略。酸堿催化。酸堿催化中，水分子之外的物質(zhì)提供質(zhì)子或接受質(zhì)子。接近催化。很多酶有兩個(gè)不同的底物，將兩種底物置于一個(gè)酶分子的同一結(jié)合面能顯著增加反應(yīng)速度。金屬離子催化。金屬離子起催化作用的方式有幾種：有的是配位作用產(chǎn)生OH-離子（親核試劑）；有的本身是親電試劑，穩(wěn)定帶負(fù)電荷的中間體；還有的作為底物與酶結(jié)合的橋梁，增加結(jié)合能、將底物置于酶分子合適位置適于催化。共七十八頁(yè)蛋白酶能促進(jìn)非常難于(nányú)發(fā)生的反應(yīng)共七十八頁(yè)圖9.1胰凝乳蛋白酶的特異性。裂解(lièjiě)芳香氨基酸或大的疏水氨基酸（已經(jīng)用桔色涂出）C-端肽鍵（用紅色標(biāo)出）。共七十八頁(yè)圖9.2胰凝乳蛋白酶具有一個(gè)(yīɡè)高度活潑的絲氨酸。用DIPF

處理，胰凝乳蛋白酶分子28個(gè)絲氨酸殘基中195位絲氨酸與DIPF反應(yīng)，導(dǎo)致胰凝乳蛋白酶失活。共七十八頁(yè)圖9.3顏色底物。胰凝乳蛋白酶水解(shuǐjiě)

N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯產(chǎn)生黃色產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚。在pH7.0，對(duì)硝基苯酚解離。共七十八頁(yè)停留法(stopped-flowmethod)

檢測(cè)反應(yīng)(fǎnyìng)的起始狀態(tài)，能夠在毫秒范圍內(nèi)混合酶和底物、跟蹤毫秒時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)(fǎnyìng)結(jié)果。結(jié)果顯示起始狀態(tài)迅速形成一種顏色產(chǎn)物，隨后緩慢（即進(jìn)入穩(wěn)態(tài)）（圖9.4）。這些結(jié)果提示：酶促反應(yīng)過(guò)程有兩個(gè)步驟，第一步很快，第二步很慢。圖9.4胰凝乳蛋白酶催化的動(dòng)力學(xué)。酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯有兩個(gè)(liǎnɡɡè)階段：快速（穩(wěn)態(tài)前）階段和穩(wěn)態(tài)階段。共七十八頁(yè)胰凝乳蛋白酶促水解反應(yīng)的兩個(gè)步驟涉及酶與底物的共價(jià)結(jié)合（圖9.5）。第一步，底物的?；c酶共價(jià)結(jié)合，同時(shí)釋放對(duì)硝基苯酚或胺類(lèi)（如果底物是酰胺鍵）。酶-?；鶑?fù)合物稱(chēng)為酰化酶中間物。第二步，?；钢虚g物水解，釋放底物的羧酸(suōsuān)組分和游離酶。酶酰化并釋放對(duì)硝基苯酚的速度很快，但是水解?；浮盎謴?fù)”游離酶的速度很慢。圖9.5共價(jià)(ɡònɡjià)催化。胰凝乳蛋白酶水解有兩個(gè)階段：（A）?；纬甚；?酶中間體；隨后(B)去酰化釋放游離酶。共七十八頁(yè)圖9.61967年DavidBlow

解析了胰凝乳蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)。球狀、三條多肽鏈、二硫鍵連接在一起(yīqǐ)。酶促活性位點(diǎn)有Ser195，位于酶表面的裂縫中（圖9.6）?；钚晕稽c(diǎn)的結(jié)構(gòu)說(shuō)明Ser195特別活潑（圖9.7）。共七十八頁(yè)Ser195的側(cè)鏈與His57的咪唑環(huán)形成氫鍵(qīnɡjiàn)，咪唑環(huán)的NH又與Asp102形成氫鍵，活性位點(diǎn)氨基酸殘基這樣的排布稱(chēng)為催化三聯(lián)體。這種排布使Ser195特別活潑。組氨酸殘基定位Ser殘基側(cè)鏈，極化Ser側(cè)鏈的羥基（去質(zhì)子）。底物存在時(shí)，His57側(cè)鏈接受Ser195側(cè)鏈羥基的質(zhì)子，因此His57是堿催化劑。Ser195丟失氫離子，產(chǎn)生烷基氧離子，其親核性比羥基大得多。Asp102協(xié)助His57定位，通過(guò)氫鍵和靜電相互作用使His57更能接受Ser195的質(zhì)子。共七十八頁(yè)第一階段反應(yīng)（酶的酰化）：第1步：底物與酶結(jié)合。第2步：His57（堿催化）接受Ser195質(zhì)子，后者的氧親核攻擊目標(biāo)肽鍵的羰基碳原子，使這個(gè)碳從平面結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成四面體結(jié)構(gòu)。羰基碳原子的四面體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定（因?yàn)轸驶瓉?lái)的氧原子帶有負(fù)電荷），但是(dànshì)氧負(fù)離子與酶蛋白的氧負(fù)離子洞的NH基團(tuán)（圖9.9）相互作用穩(wěn)定，從而穩(wěn)定羰基碳原子四面體（轉(zhuǎn)化態(tài)）。第3步，四面體崩潰產(chǎn)生酰化酶。His57的正電荷側(cè)鏈給要斷裂肽鍵的氨基提供質(zhì)子（酸催化）。第4步，斷裂肽鍵的氨基成分離開(kāi)酶共七十八頁(yè)共七十八頁(yè)第二階段是酶的脫酰反應(yīng)。酰化酶酯鍵的水解反應(yīng)基本上是重復(fù)第2至第4步。第5步：水分子占據(jù)先前底物氨基成分所在的位置(wèizhi)。第6步：His57（作為堿催化劑）的咪唑環(huán)吸收水分子的質(zhì)子，產(chǎn)生的OH-離子攻擊酰基的碳原子，形成四面體碳原子。第7步：His57作為酸催化劑，提供質(zhì)子導(dǎo)致四面體碳原子崩潰，斷裂形成羧基。第8步：釋放羧酸產(chǎn)物和游離酶。共七十八頁(yè)共七十八頁(yè)圖9.8胰凝乳蛋白酶水解肽鍵的催化反應(yīng)可以解釋共價(jià)催化和酸堿催化機(jī)制。反應(yīng)(fǎnyìng)過(guò)程包括8步：（1）底物結(jié)合；（2）絲氨酸親核攻擊肽鍵的羰基碳原子；（3）四面體崩潰；（4）氨基組分釋放；（5）水分子結(jié)合；（6）水分子親核攻擊?；钢虚g體；（7）四面體崩潰；（8）羧酸成分釋放。虛線表示氫鍵。共七十八頁(yè)圖9.9氧負(fù)離子洞。胰凝乳蛋白酶促反應(yīng)的氧負(fù)離子中間體用氧負(fù)離子洞穩(wěn)定。氧負(fù)離子洞的肽鍵(tàijiàn)NH與氧負(fù)離子中間體形成氫鍵（綠色虛線）。共七十八頁(yè)該機(jī)制(jīzhì)能解釋胰凝乳蛋白酶促反應(yīng)的所有特征，但不能解釋這個(gè)酶的底物特異性。

酶與底物類(lèi)似物和抑制劑形成復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)酶分子有一個(gè)相對(duì)疏水的深口袋，成為S1口袋，適于長(zhǎng)的非極性氨基酸側(cè)鏈。適當(dāng)側(cè)鏈與該口袋結(jié)合將鄰位肽鍵定位于斷裂位點(diǎn)（圖9.10）。胰凝乳蛋白酶的底物特異性幾乎完全取決于肽鍵N-端的氨基酸側(cè)鏈。共七十八頁(yè)圖9.10胰凝乳蛋白酶特異性口袋。胰凝乳蛋白酶底物結(jié)合口袋用相對(duì)疏水的殘基構(gòu)建、很深，有助于結(jié)合長(zhǎng)的疏水性(shuǐxìng)殘基如苯丙氨酸（綠色）側(cè)鏈?；钚晕稽c(diǎn)195位Ser定位在斷裂肽鍵。構(gòu)成結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基已經(jīng)標(biāo)出。共七十八頁(yè)其他蛋白酶的底物(dǐwù)特異性更為復(fù)雜。這些酶分子表面還有其他口袋識(shí)別底物(dǐwù)分子的其他殘基。斷裂肽鍵的N-端殘基分別稱(chēng)為P1，P2，P3（從C-斷向N-端編號(hào)），斷裂肽鍵C-端氨基酸殘基分別是P1',P2',P3'（從N-端向C-端編號(hào)）。相應(yīng)地，結(jié)合這些位點(diǎn)的口袋對(duì)應(yīng)地稱(chēng)為S1,S2或S1',S2'等。圖9.11蛋白酶和底物先互作用的命名方法。底物與酶潛在的相互作用位點(diǎn)用紅色的P表示。酶分子(fēnzǐ)相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)用S表示。斷裂肽鍵（用紅色標(biāo)出）是這種命名的參考位點(diǎn)。共七十八頁(yè)圖9.12胰蛋白酶和胰凝乳(nínɡrǔ)蛋白酶的結(jié)構(gòu)類(lèi)似性。將胰凝乳蛋白酶（紅色）置于胰蛋白酶（藍(lán)色）之上，顯示兩者相似度很高。此處僅顯示a-碳原子骨架。兩種蛋白質(zhì)分子之間a-碳原子誤差是1.7A。共七十八頁(yè)圖9.9胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶(yídànbáiméi)、和彈性蛋白酶的S1口袋。有些氨基酸殘基在決定這些酶的特異性方面起關(guān)鍵作用。用顏色標(biāo)出了這些殘基的側(cè)鏈和活性位點(diǎn)的絲氨酸。共七十八頁(yè)枯草桿菌蛋白酶（不是胰凝乳蛋白酶同源(tónɡyuán)物）也有催化三聯(lián)體活性位點(diǎn)和氧離子洞，但是這個(gè)酶的氧離子洞的一個(gè)氨基來(lái)自天冬酰胺殘基的側(cè)鏈而不是肽鏈骨架（圖9.14）?？莶輻U菌蛋白酶屬于另一蛋白酶家族，在古生菌、細(xì)菌、和真核生物發(fā)現(xiàn)了這一蛋白酶家族成員。圖9.14枯草桿菌的催化三聯(lián)體和氧負(fù)離子洞。氧負(fù)離子洞的兩個(gè)氨基分別來(lái)自肽鏈骨架(gǔjià)氨基和Asn155的側(cè)鏈氨基。這兩個(gè)氨基能夠穩(wěn)定活性中心Ser221親核攻擊肽鍵碳原子所形成的氧負(fù)離子。共七十八頁(yè)小麥羧肽酶II有催化三體，但是這個(gè)酶與胰凝乳(nínɡrǔ)蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶都沒(méi)有明顯的類(lèi)似性（圖9.15）。圖9.15羧肽酶II。小麥羧肽酶II的結(jié)構(gòu)（右邊），有兩條肽鏈（分別用藍(lán)色和紅色標(biāo)出）。活性中心的催化三體（左邊）與胰凝乳蛋白酶的組成相同。但是該酶與胰凝乳蛋白酶沒(méi)有相似之處。形成氧離子洞的氨基酸殘基用黃色涂出。該蛋白質(zhì)屬于(shǔyú)另一蛋白家族，包括乙酰膽堿酯酶和脂質(zhì)酶。在這些酶中，用組氨酸活化的親核試劑可能是半胱氨酸而不是絲氨酸。共七十八頁(yè)最后，還有一類(lèi)蛋白酶活性位點(diǎn)的絲氨酸或蘇氨酸不是用天冬氨酸-組氨酸對(duì)活化，而是用賴氨酸側(cè)鏈氨基(ānjī)或肽鏈N-端氨基活化。因此，蛋白酶活性中心的催化三體在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的時(shí)間點(diǎn)至少有三個(gè)。這類(lèi)催化策略在水解肽及相關(guān)化學(xué)鍵方面尤為有效。共七十八頁(yè)定點(diǎn)(dìnɡdiǎn)突變研究

共七十八頁(yè)定點(diǎn)突變也能研究氧離子洞對(duì)催化反應(yīng)的重要性。Asn155突變成甘氨酸能消除(xiāochú)枯草桿菌氧負(fù)離子洞的一個(gè)氨基，kcat值降至野生型酶的0.2%，Km值增加兩倍。這些結(jié)果顯示天冬酰胺的NH基團(tuán)在穩(wěn)定羰基碳四面體中間物以及形成該四面體的轉(zhuǎn)化態(tài)方面起重要作用。共七十八頁(yè)其他(qítā)種類(lèi)的肽水解酶:半胱氨酸蛋白酶組氨酸殘基活化半胱氨酸，后者親核攻擊肽鍵（與絲氨酸蛋白酶的絲氨酸相似)。木瓜蛋白酶(papain)是研究最深入的半胱氨酸蛋白酶。與該酶同源的哺乳動(dòng)物蛋白酶有組織蛋白酶（cathepsins)，在免疫系統(tǒng)和其他系統(tǒng)起作用。Caspases也是半胱氨酸蛋白酶，負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡，但是Caspases的結(jié)構(gòu)與木瓜蛋白酶沒(méi)有關(guān)系。因此在進(jìn)化過(guò)程中，半胱氨酸蛋白酶至少(zhìshǎo)獨(dú)立出現(xiàn)兩次。共七十八頁(yè)其他(qítā)種類(lèi)的肽水解酶:天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)中心有一對(duì)天冬氨酸，聯(lián)合作用活化水分子，后者攻擊肽鍵。一個(gè)天冬氨酸去質(zhì)子，攻擊水分子（使之脫去質(zhì)子）。另一個(gè)天冬氨酸有質(zhì)子，極化(jíhuà)肽鍵使肽鍵對(duì)親核攻擊敏感。這類(lèi)蛋白酶包括腎素，HIV蛋白酶。共七十八頁(yè)活性位點(diǎn)有金屬離子（幾乎都是鋅離子）。金屬離子活化水分子，后者親核攻擊肽鍵(tàijiàn)的羰基。嗜熱細(xì)菌蛋白酶（thermolysin）和消化酶羧肽酶A是鋅離子蛋白酶。嗜熱菌蛋白酶是鋅蛋白酶家族成員。這個(gè)家族很大，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（負(fù)責(zé)組織重構(gòu)和組織降解）。但是羧肽酶A不屬于這一家族。其他種類(lèi)(zhǒnglèi)的肽水解酶:金屬蛋白酶共七十八頁(yè)講到此.共七十八頁(yè)圖9.19HIV蛋白酶是二聚體天冬氨酸蛋白酶。兩個(gè)亞基完全相同（分別用藍(lán)色和黃色表示）。每個(gè)亞基（有99個(gè)氨基酸）給活性位點(diǎn)提供一個(gè)Asp。底物(dǐwù)結(jié)合后關(guān)閉結(jié)合口袋的扇翼結(jié)構(gòu)。共七十八頁(yè)圖9.20

Indinavir

是HIV蛋白酶抑制劑。Indinavir(crixivan)的結(jié)構(gòu)與HIV蛋白酶底物多肽的結(jié)構(gòu)比較(bǐjiào)。底物斷裂化學(xué)鍵用紅色標(biāo)出。共七十八頁(yè)Indinavir的醇與四面體中間(zhōngjiān)物很相似，其它基團(tuán)與酶分子識(shí)別位點(diǎn)S2,S1,S1’,和S2’結(jié)合。在活性位點(diǎn)，indinavir采用的構(gòu)型接近于酶蛋白的二重對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。結(jié)合抑制劑后可變翼蓋住HIV蛋白酶活性位點(diǎn)。抑制劑中心醇羥基與活性位點(diǎn)兩個(gè)Asp相互作用。抑制劑的兩個(gè)羰基與水分子形成氫鍵(在圖9.21沒(méi)有繪出)，而水分子又與兩翼的肽鍵NH基團(tuán)形成氫鍵。這種互作模式不可能出現(xiàn)(chūxiàn)在抑制劑與細(xì)胞天冬氨酸蛋白酶（如腎素）之間。這些決定indinavir抑制HIV的特異性。共七十八頁(yè)碳酸脫水酶：37℃，中性pH，沒(méi)有催化劑，CO2的水合速度常數(shù)相當(dāng)于一級(jí)反應(yīng)速度k1=0.15s-1。而碳酸脫水生成CO2的逆反應(yīng)速度是k-1=50s-1（更快）。相應(yīng)的平衡常數(shù)K1=5.4x10-5，即平衡時(shí)[CO2]/[H2CO3]是340:1。

CO2水合和HCO3-脫水常常與快速過(guò)程（尤其是運(yùn)輸過(guò)程）偶聯(lián)。幾乎所有生物都有碳酸脫水酶。碳酸脫水酶能夠?qū)⒎磻?yīng)速度增加到自動(dòng)反應(yīng)的合理速度之上。1.血液流過(guò)肺，碳酸脫水酶將HCO3-

脫水生成CO2。相反，碳酸脫水酶能夠?qū)O2水合生成HCO3-

，產(chǎn)生眼淚或其它分泌液。2.HCO3-和CO2是不同酶促反應(yīng)的產(chǎn)物或底物?？焖俎D(zhuǎn)化HCO3-和CO2才能保證這些分子處于合適的濃度水平。3.這些酶促反應(yīng)非常重要(zhòngyào)。碳酸脫水酶突變會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)硬化（osteopetrosis）(密度過(guò)高，貧血)和精神障礙。共七十八頁(yè)碳酸脫水酶能加速CO2水合生成(shēnɡchénɡ)HCO3-?；钚宰罡叩奶妓崦撍杆螩O2的速度達(dá)到kcat=106s-1，即一個(gè)酶分子每秒能轉(zhuǎn)化100萬(wàn)分子?；镜奈锢磉^(guò)程如擴(kuò)散和質(zhì)子轉(zhuǎn)移達(dá)不到這么高的水合速率，因此酶促反應(yīng)必需采用特別的策略獲得如此巨大的（prodigious）速度。共七十八頁(yè)碳酸脫水酶含有催化活性必需的鋅離子在碳酸脫水酶發(fā)現(xiàn)（1932年）10年后，發(fā)現(xiàn)這個(gè)酶有鋅離子，證實(shí)酶活性必需鋅離子—發(fā)現(xiàn)的第一例含鋅離子的酶（當(dāng)時(shí)的重大發(fā)現(xiàn)）。現(xiàn)在知道，生物體內(nèi)超過(guò)1/3的酶要么有金屬離子，要么用金屬離子作為輔助因子。金屬離子有幾個(gè)性質(zhì)增加反應(yīng)活性：帶正電荷；能形成相對(duì)強(qiáng)但相當(dāng)(xiāngdāng)活潑的化學(xué)鍵；有的金屬離子有多種氧化狀態(tài)。金屬離子的化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)提供了進(jìn)化過(guò)程中很多酶利用金屬離子進(jìn)行催化的理由。人類(lèi)基因組至少有7種碳酸脫水酶（每種酶都有自身基因）。這些碳酸脫水酶序列一致性明顯，是同源酶。共七十八頁(yè)x-射線(shèxiàn)晶體學(xué)研究提供鋅離子的詳細(xì)而又直接的信息。碳酸脫水酶II是紅細(xì)胞的主要成分，是研究得最深入（圖9.22），也是活性最高的碳酸脫水酶之一。共七十八頁(yè)催化經(jīng)過(guò)鋅離子活化水分子：鋅離子復(fù)合物有利于二氧化碳水合。pH值對(duì)酶促二氧化碳水合反應(yīng)(fǎnyìng)的影響（圖9.23）。共七十八頁(yè)在pH8，反應(yīng)速度接近最大值。pH值降低，反應(yīng)速度迅速下降。在pH7.0反應(yīng)速度降低一半，提示pH7.0失去(shīqù)一個(gè)基團(tuán)(pKa=7.0)的一半，這個(gè)基團(tuán)對(duì)催化反應(yīng)很重要。而且這個(gè)曲線顯示，高pH值（脫質(zhì)子）形成該基團(tuán)能有效地催化。盡管有些氨基酸，如組氨酸的pKa值接近7，但是不同證據(jù)提示負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化的基團(tuán)不是氨基酸而是鋅結(jié)合的水分子。圖9.24鋅離子結(jié)合(jiéhé)水分子的pKa值。與鋅離子結(jié)合使水分子的pKa值從15.7降低至7。共七十八頁(yè)（1）鋅離子有利于水分子釋放H+離子，產(chǎn)生氫氧根離子。（2）二氧化碳底物結(jié)合于酶活性位點(diǎn)，并被定位于與氫氧根反應(yīng)(fǎnyìng)的位置。（3）氫氧根攻擊二氧化碳，產(chǎn)生碳酸氫根離子（HCO3-）。（4）釋放HCO3-后，又產(chǎn)生催化活性位點(diǎn)結(jié)合另一個(gè)水分子。共七十八頁(yè)合成類(lèi)似物有四個(gè)氮原子與鋅離子結(jié)合（碳酸脫水酶是三個(gè)配位鍵）。一個(gè)水分子與鋅離子還能形成(xíngchéng)配位鍵。直接測(cè)定顯示鋅結(jié)合水分子的pKa值是8.7，沒(méi)有碳酸脫水酶結(jié)合水分子的pKa值那么低（但比游離水分子的pKa值顯著降低）。在pH9.2，這個(gè)類(lèi)似物催化二氧化碳水合速度提高100倍以上。盡管催化速度比碳酸脫水酶低很多，但是模型系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示鋅結(jié)合氫氧根離子的機(jī)制是正確的。碳酸脫水酶進(jìn)化使之能夠利用鋅結(jié)合的氫氧根離子作為強(qiáng)催化劑。共七十八頁(yè)圖9.27水脫質(zhì)子的動(dòng)力學(xué)。碳酸脫水酶中鋅離子結(jié)合(jiéhé)水分子的脫質(zhì)子反應(yīng)和結(jié)合(jiéhé)質(zhì)子反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。共七十八頁(yè)圖9.28緩沖液對(duì)脫質(zhì)子(zhìzǐ)反應(yīng)的影響。緩沖液組分B協(xié)助鋅結(jié)合水分子脫質(zhì)子。共七十八頁(yè)圖9.29緩沖液濃度對(duì)碳酸脫水酶催化(cuīhuà)二氧化碳水合反應(yīng)速度的影響。隨著緩沖液1,2-二甲基苯咪唑濃度的增加，二氧化碳水合反應(yīng)速率增加。緩沖液使酶催化產(chǎn)生很高的反應(yīng)速率。共七十八頁(yè)圖9.30組氨酸質(zhì)子穿梭。（1）His64消除鋅離子結(jié)合水的質(zhì)子，產(chǎn)生(chǎnshēng)親核氫氧根離子和質(zhì)子化組氨酸；（2）緩沖液B從這個(gè)組氨酸移去質(zhì)子，再生沒(méi)有質(zhì)子化的組氨酸。共七十八頁(yè)同一進(jìn)化(convergentevolution)使不同的碳酸脫水酶產(chǎn)生鋅結(jié)合位點(diǎn)與人碳酸脫水酶同源的碳酸脫水酶叫a-碳酸脫水酶，常見(jiàn)于動(dòng)物、一些細(xì)菌和藻類(lèi)。另有兩類(lèi)碳酸脫水酶，與a-碳酸脫水酶沒(méi)有序列類(lèi)似性。b-碳酸脫水酶見(jiàn)于高等植物和很多細(xì)菌，包括E.coli。光譜和結(jié)構(gòu)研究(yánjiū)顯示b-碳酸脫水酶的鋅離子與一個(gè)組氨酸和兩個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合，但是這個(gè)酶蛋白的總結(jié)構(gòu)與a-碳酸脫水酶無(wú)關(guān)。在植物中，這些酶有助于CO2積累，CO2對(duì)光合成的Calvin循環(huán)是非常關(guān)鍵的。古生菌Methanosarcinathermophila的碳酸脫水酶屬于第三類(lèi)碳酸脫水酶，即g-碳酸脫水酶。晶體結(jié)構(gòu)顯示g-碳酸脫水酶鋅離子的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與a-碳酸脫水酶非常相像。但是鋅離子的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)處于三聚體g-碳酸脫水酶三個(gè)亞基之間的界面（圖9.31）。酶蛋白分子有非常顯著的左手b-螺旋結(jié)構(gòu)（b-鏈扭曲成左手螺旋），與a-和b-碳酸脫水酶的結(jié)構(gòu)不同。因此，在進(jìn)化過(guò)程中至少有三次同一進(jìn)化。產(chǎn)生鋅離子配位鍵結(jié)合的碳酸脫水酶。共七十八頁(yè)圖9.31g-碳酸脫水酶。（左邊）g-碳酸脫水酶的鋅離子位點(diǎn)。鋅離子與三個(gè)組氨酸和一個(gè)水分子結(jié)合。（中間）這個(gè)蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)。三個(gè)亞基分別是A，B，和C。每條鏈主要是左手b-螺旋。（右邊(yòubian)）從頂部觀察這個(gè)三聚體，顯示該蛋白呈三重對(duì)稱(chēng)。鋅離子位置由綠色表示，處于亞基界面之間。共七十八頁(yè)圖9.32用修飾保護(hù)DNA。EcoRV的識(shí)別序列（左邊），和免受這個(gè)限制酶斷裂(duànliè)DNA的甲基化位點(diǎn)（右邊）。限制性核酸(hésuān)內(nèi)切酶：共七十八頁(yè)圖9.33磷酸二酯鍵水解。所有限制性核酸內(nèi)切酶催化DNA磷酸二酯鍵水解的產(chǎn)物是磷酸處于(chǔyú)5’-端。斷裂化學(xué)鍵用紅色標(biāo)出。共七十八頁(yè)機(jī)制(jīzhì)一（共價(jià)中間體，產(chǎn)物構(gòu)型與底物相同）共七十八頁(yè)機(jī)制二（直接(zhíjiē)水解），構(gòu)型轉(zhuǎn)換共七十八頁(yè)用兩種親核試劑攻擊磷所形成的產(chǎn)物(chǎnwù)支持流水線替代正確。共七十八頁(yè)硫代磷酸的EcoRV底物（圖9.34）。然后用富含18O標(biāo)記(biāojì)水分子水解。18O相應(yīng)于磷原子的位置確定磷原子的構(gòu)型是維持還是轉(zhuǎn)換。結(jié)果顯示，磷原子構(gòu)型轉(zhuǎn)換了一次，證明水分子直接攻擊導(dǎo)致磷酸二酯鍵斷裂。酶促反應(yīng)過(guò)程沒(méi)有共價(jià)中間體這一步。共七十八頁(yè)圖9.35DNA裂解(lièjiě)得立體化學(xué)。EcoRV酶促反應(yīng)斷裂磷酸二酯鍵導(dǎo)致磷原子構(gòu)型完全翻轉(zhuǎn)（此時(shí)磷原子與一個(gè)硫原子，一個(gè)18O原子，一個(gè)16O原子，和一個(gè)與核苷酸連接的16O原子結(jié)合）。這一結(jié)果強(qiáng)烈提示限制性內(nèi)切酶促反應(yīng)是水分子直接攻擊磷原子。共七十八頁(yè)在Mg2+或類(lèi)似的二價(jià)陽(yáng)離子存在的情況下，將酶蛋白與底物分子結(jié)晶能夠直接觀察酶蛋白與底物之間的復(fù)合物是不可能的。因?yàn)槊傅鞍啄軌蛄呀獾孜?。但是，可以通過(guò)幾種途徑觀察酶蛋白與金屬離子形成的復(fù)合物。一條途徑是沒(méi)有Mg2+或類(lèi)似的二價(jià)陽(yáng)離子時(shí)，將酶蛋白與識(shí)別(shíbié)序列（即配體）混合后結(jié)晶。由于缺乏金屬離子，能夠長(zhǎng)出相應(yīng)得晶體。然后將相應(yīng)得蛋白質(zhì)晶體置于含有金屬離子的溶液中浸泡。另一種方案是用活性很低的突變酶與相應(yīng)的底物、金屬離子一道結(jié)晶。最后用Ca2+替代Mg2+，將酶蛋白、底物和金屬離子一道結(jié)晶（Ca2+作為輔助因子，酶蛋白的催化活性很弱）。所有這些操作都是使酶促反應(yīng)不發(fā)生，從而能夠確定金屬離子的位置。由于每個(gè)活性位點(diǎn)有三個(gè)金屬離子。多個(gè)金屬離子在活性位點(diǎn)的具體作用仍在研究中。一個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)在所有結(jié)構(gòu)（指前面不同方法所獲得的結(jié)構(gòu)）都出現(xiàn)。這個(gè)金屬離子與蛋白質(zhì)兩個(gè)天冬氨酸和接近核酸斷裂位點(diǎn)的一個(gè)磷氧基團(tuán)形成配位鍵。該金屬離子協(xié)助水分子定位，并活化水分子（類(lèi)似碳酸脫水酶的Zn2+活化水分子），結(jié)合的水分子攻擊磷原子（圖9.36）。共七十八頁(yè)圖9.36EcoRV核酸(hésuān)內(nèi)切酶的一個(gè)Mg2+結(jié)合位點(diǎn)。鎂離子活化水分子，協(xié)助水分子定位，使之能夠攻擊磷原子。已經(jīng)(yǐjing)斷裂共七十八頁(yè)圖9.37EcoRV識(shí)別序列(xùliè)的結(jié)構(gòu)。（A）識(shí)別序列是圍繞軸（綠色）的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)序列。（B）EcoRV識(shí)別序列的倒置重復(fù)具有二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)。共七十八頁(yè)限制性核酸內(nèi)切酶也有相應(yīng)的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)(jiégòu)：二聚體酶的兩個(gè)亞基也是二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)(jiégòu)。酶與識(shí)別序列結(jié)構(gòu)(jiégòu)匹配有助于酶對(duì)DNA配體（即底物）的識(shí)別。蛋白質(zhì)與帶有識(shí)別序列的DNA分子形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)證實(shí)酶與底物分子結(jié)構(gòu)相似（圖9.38）。酶緊緊地?fù)肀NAs。共七十八頁(yè)圖9.39EcoRV擁抱DNA底物分子(fēnzǐ)之間形成的氫鍵。右邊EcoRV分子的一個(gè)DNA結(jié)合環(huán)（綠色）與配體DNA分子之間的結(jié)合。圖B顯示與CG堿基對(duì)形成氫鍵的EcoRV酶蛋白分子的氨基酸殘基，圖C顯示與TA堿基對(duì)形成氫鍵的EcoRV酶蛋白分子的氨基酸殘基共七十八頁(yè)圖9.40識(shí)別位點(diǎn)的扭曲。DNA用球-棒模型表示。DNA雙螺旋軸用紅線表示(biǎoshì)。與酶結(jié)合發(fā)生明顯扭曲。B型DNA雙螺旋軸是直的(沒(méi)有繪出)。共七十八頁(yè)圖9.41EcoRV與配體及非配體DNA分子的結(jié)合。非配體DNA(橘色)和配體DNA(紅色)與EcoRV酶蛋白分子的結(jié)合。注意非配體DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合因距離太遠(yuǎn)，無(wú)法(wúfǎ)構(gòu)建完整的Mg2+結(jié)合位點(diǎn)。共七十八頁(yè)圖9.42與非配體DNA相比，配體DNA與EcoRV的結(jié)合能高。配體DNA與EcoRV分子結(jié)合多余的結(jié)合能（與非配體DNA-EcoRV復(fù)合物相比）用于DNA扭曲，從而構(gòu)建(ɡòujiàn)出完整的催化活性位點(diǎn)。共七十八頁(yè)甲基化，無(wú)法(wúfǎ)扭曲。圖9.43腺嘌呤甲基化。腺嘌呤甲基化阻止EcoRV與配體DNA之間形成氫鍵(qīnɡjiàn)，因此阻止了DNA的酶促斷裂。共七十八頁(yè)基因水平轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)證據(jù)：進(jìn)化關(guān)系疏遠(yuǎn)的生物，限制酶序列一致性高。遺傳密碼與宿主很不相同。圖9.44II類(lèi)限制性內(nèi)切酶的保守核心結(jié)構(gòu)。用顏色重點(diǎn)(zhòngdiǎn)標(biāo)出每個(gè)酶蛋白二聚體的單一亞基含有形成活性位點(diǎn)區(qū)域（藍(lán)色）的四個(gè)保守結(jié)構(gòu)元件。共七十八頁(yè)核苷單磷酸激酶催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移核苷單磷酸激酶（NMPkinase）用腺苷酸激酶作為代表。這些酶催化核苷三磷酸（NTP，通常是ATP）末端的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給核苷單磷酸(NMP)的磷酸（圖9.45）。NMP激酶的主要挑戰(zhàn)是將NTP的磷酸轉(zhuǎn)移給NMP，但不促進(jìn)磷酸轉(zhuǎn)移給水分子（即NTP水解反應(yīng)）。利用誘導(dǎo)匹配(pǐpèi)來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。而且，金屬離子在這個(gè)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。但是，金屬離子與底物而不是與酶蛋白形成復(fù)合物。共七十八頁(yè)圖9.45核苷單磷酸激酶轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)磷酸基團(tuán)。這些酶催化磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)將核苷三磷酸（此處是ATP）和核苷單磷酸（NMP）轉(zhuǎn)化成兩個(gè)核苷二磷酸。共七十八頁(yè)圖9.46腺苷酸激酶和