2025屆高考生物一輪復(fù)習(xí)新考案-大單元11生物技術(shù)與工程第58講基因工程的基本工具與操作程序(人教版2019)

第58講基因工程的基本工具與操作程序【課標內(nèi)容】1．概述基因工程是在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來的；2．闡明重組DNA技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具；3．闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細胞和目的基因及其表達產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟?？键c1基因工程的基本工具考點落實知識1基因工程概述基因工程又叫作重組DNA技術(shù)。項目內(nèi)容主要技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作環(huán)境__體外__操作水平__DNA分子水平__理論依據(jù)基因重組供體提供__目的基因__受體表達目的基因基本過程切割→改造和拼接→導(dǎo)入→表達優(yōu)點克服__遠緣雜交不親和__的障礙，定向改造生物的__遺傳性狀__知識2基因工程的基本工具1．限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)圖中可見，限制酶在識別序列中心軸線兩側(cè)切開產(chǎn)生的是__黏性末端__，在識別序列中心軸線處切開產(chǎn)生的是__平末端__。2．DNA連接酶(1)作用：在兩個核苷酸之間形成__磷酸二酯鍵__以連接兩個DNA片段。解疑釋惑限制酶和DNA連接酶的關(guān)系圖示(2)類型歸納總結(jié)與DNA有關(guān)的酶酶作用作用相關(guān)“鍵”限制酶切割DNA片段，產(chǎn)生兩個(具有相同黏性末端或平末端)DNA片段破壞磷酸二酯鍵DNA連接酶催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，從而連接起來形成磷酸二酯鍵解旋酶將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈破壞氫鍵(非化學(xué)鍵)DNA聚合酶把游離的脫氧核苷酸連接到引物或者已有的DNA單鏈的3′端上形成磷酸二酯鍵DNA(水解)酶將DNA水解為脫氧核苷酸破壞磷酸二酯鍵3．載體(1)作用：將基因送入細胞。(2)種類：質(zhì)粒、__噬菌體__、動植物病毒等。(3)重要的載體之一——質(zhì)粒①質(zhì)粒的本質(zhì)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單，獨立于真核細胞的細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的__環(huán)狀雙鏈DNA分子__。②質(zhì)粒適于作基因載體的特點(載體須具備的條件)特點(條件)作用有一個至多個__限制酶切割位點__供外源DNA片段插入其中能在細胞中進行__自我復(fù)制__，或整合到受體DNA上，隨受體細胞DNA同步復(fù)制—帶有__標記基因__(常是人工改造后具有)，一般為抗生素抗性基因或熒光基因等便于重組DNA分子的篩選(鑒定目的基因是否導(dǎo)入成功)深度指津最常見的標記基因——抗生素抗性基因目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，使受體細胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細胞，原理如下圖所示(以氨芐青霉素抗性基因為例)：概念思辨1．判斷下列說法的正誤：(1)目前使用的限制酶都是從原核生物中得到的。(×)提示：限制酶主要是從原核生物中得到的，目前許多已商業(yè)化生產(chǎn)。(2)質(zhì)粒是存在于細菌細胞中的一種細胞器。(×)提示：質(zhì)粒不是細胞器。(3)重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、DNA連接酶和載體。(×)提示：重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、DNA連接酶。(4)不同的限制酶切割DNA，可能得到相同的黏性末端。(√)(5)用DNA連接酶可連接兩種來源不同的DNA。(√)(6)用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，是為了獲得相同的黏性末端，以便連接。(√)(7)限制酶的識別序列都由6個核苷酸組成。(×)提示：大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。2．限制酶在原核生物中的作用是什么？它會不會切割自己的DNA分子？提示：原核細胞中的限制酶能夠切割入侵的外源DNA而保護自身。原核細胞中的限制酶不會切割自己的DNA分子，是因為酶具有專一性或自己的DNA分子已被修飾而不被識別。3．將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切割__2__處，同時產(chǎn)生__4__個黏性末端或平末端。而切割質(zhì)粒則只需要限制酶剪切1次，因為__質(zhì)粒是環(huán)狀DNA分子__。典題說法考向1基因工程中工具酶的選擇和利用(2010·江蘇卷)下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答下列問題：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ識別序列及切割位點eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖1))eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖2))(1)一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有__0、2__個游離的磷酸基團。(2)若對圖中質(zhì)粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越__高__。(3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是__SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因__。(4)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止__質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化__。(5)為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入__DNA連接__酶。(6)重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是__鑒別和篩選含有目的基因的細胞__。解析：(1)質(zhì)粒切割前是雙鏈環(huán)狀DNA分子，所有磷酸基團參與形成磷酸二酯鍵，故不含游離的磷酸基團。從圖1可以看出，質(zhì)粒上只含有一個SmaⅠ的切點，因此被該酶切割后，質(zhì)粒變?yōu)榫€性雙鏈DNA分子，因每條鏈上含有一個游離的磷酸基團，因此切割后含有兩個游離的磷酸基團。(2)由題目可知，SmaⅠ識別的DNA序列只有G和C，而G和C之間可以形成三個氫鍵，A和T之間可以形成兩個氫鍵，所以SmaⅠ酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性就越高。(3)質(zhì)?？股乜剐曰驗闃擞浕?，由圖2可知，標記基因和外源DNA目的基因中均含有SmaⅠ酶切位點，都可以被SmaⅠ破壞，故不能使用該酶剪切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA。(4)只使用EcoRⅠ，則質(zhì)粒和目的基因兩端的黏性末端相同，用DNA連接酶連接時，會產(chǎn)生質(zhì)粒和目的基因的自身連接物，而利用BamHⅠ和HindⅢ剪切時，質(zhì)粒和目的基因兩端的黏性末端不同，用DNA連接酶連接時，不會產(chǎn)生自身連接產(chǎn)物。(5)質(zhì)粒和目的基因連接后獲得重組質(zhì)粒，該過程需要DNA連接酶作用，故混合后加入DNA連接酶。(6)質(zhì)粒上的抗性基因為標記基因，用于鑒別和篩選含有重組質(zhì)粒的受體細胞。深度指津?qū)ο拗泼盖懈钗稽c的三點要求(1)位置要求：限制酶切割位點所處的位置必須在標記基因外，只有這樣才能保證標記基因的完整性。(2)數(shù)量要求：選擇限制酶切割目的基因時，被選擇的限制酶在目的基因的兩側(cè)都要有識別序列，這樣才能切割出完整的目的基因。(3)對象要求①在獲取目的基因和切割載體時通常用同一種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同時，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。②為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，可用不同的限制酶分別處理目的基因和載體(要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點)，使目的基因兩側(cè)及載體上具有兩個不同的末端。③所選擇的限制酶不能破壞標記基因，如質(zhì)粒上有兩個或兩個以上標記基因，則要求至少保留一種能用于篩選。(2023·新課標卷)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點)和質(zhì)粒進行切割、連接，以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(C)eq\a\vs4\al(\x(),)A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E．coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coliDNA連接酶連接解析：酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達載體的構(gòu)建方案最合理且高效；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續(xù)的篩選?？枷?基因載體和標記基因關(guān)于基因表達載體的敘述，錯誤的是(C)A．基因表達載體能協(xié)助目的基因在受體細胞中復(fù)制B．具有一個或多個限制酶切點，以便目的基因的插入C．終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使翻譯在所需要的地方停下來D．載體上常有特殊的標記基因，便于重組DNA分子的篩選解析：基因表達載體上有復(fù)制原點，能協(xié)助目的基因在受體細胞中復(fù)制，A正確；作為載體必須具備的條件之一是具有一個或多個限制酶切點，以便目的基因能夠與之結(jié)合，B正確；終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來，C錯誤；載體上需要具有某些標記基因，以便于重組DNA分子的篩選，D正確?？键c2基因工程的操作程序考點落實知識1基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取2．基因表達載體的構(gòu)建(核心工作)(1)過程(2)基因表達載體的組成深度指津啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子(1)啟動子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的__DNA片段__，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點。終止子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游。(2)起始密碼子和終止密碼子位于__mRNA__上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。3．將目的基因?qū)胧荏w細胞受體細胞常用方法操作過程植物細胞(常用體細胞或受精卵)__花粉管通道法__(我國獨創(chuàng))方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房；方法二：將DNA溶液滴加在授粉后一定時間內(nèi)的花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊__農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法__將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上→農(nóng)桿菌→感染植物細胞→T－DNA整合到受體細胞染色體的DNA上→表達動物細胞(常用受精卵)__顯微注射法__將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物微生物細胞__Ca2+處理法__(感受態(tài)細胞法)Ca2+處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收周圍環(huán)境中的DNA分子解疑釋惑(1)目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為__轉(zhuǎn)化__。實質(zhì)是目的基因整合到受體細胞染色體基因組中。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：農(nóng)桿菌易感染植物細胞，并將其Ti質(zhì)粒上的__T－DNA__轉(zhuǎn)移并整合到受體細胞染色體DNA上。4．目的基因的檢測與鑒定(1)通過__PCR__等技術(shù)檢測目的基因是否導(dǎo)入或是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(2)利用__抗原—抗體雜交__技術(shù)檢測目的基因是否翻譯。(3)進行個體生物學(xué)水平的抗蟲、抗病、功能活性等鑒定。知識2PCR技術(shù)1．原理：__DNA半保留復(fù)制__和DNA的熱變性。2．特點：可在短時間內(nèi)__大量擴增__目的基因。3．PCR反應(yīng)所需的條件條件作用有一段已知目的基因的核苷酸序列便于合成__引物__在一定的__緩沖液__中進行提供相對穩(wěn)定的pH環(huán)境4種脫氧核苷酸(實際上用脫氧核苷三磷酸，即dNTP)作為合成DNA子鏈的__原料__，同時提供__能量__DNA母鏈作為DNA復(fù)制的模板__耐高溫__的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)催化合成DNA子鏈引物(是一小段__短單鏈核酸__，作為DNA復(fù)制的起始序列，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對)使DNA聚合酶能夠從引物的__3′__端開始連接脫氧核苷酸4．過程及圖解循環(huán)重復(fù)上述過程，n次循環(huán)后，目的基因的量將被擴增__2n__倍。概念思辨1．判斷下列說法的正誤：(1)利用PCR技術(shù)擴增目的基因時，兩種引物的堿基序列應(yīng)互補。(×)提示：利用PCR技術(shù)擴增目的基因時，兩種引物間的堿基序列不能互補。(2)目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。(√)(3)體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR過程中，都是一條鏈連續(xù)復(fù)制(前導(dǎo)鏈)，一條鏈不連續(xù)(后隨鏈)。(×)提示：PCR中，兩條子鏈都是連續(xù)合成的。(4)構(gòu)建基因表達載體時，須將目的基因插入啟動子與終止子之間。(√)(5)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法常用的受體細胞是花粉細胞。(×)提示：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的受體細胞常見的是雙子葉植物和裸子植物體細胞，目前該方法在某些單子葉植物中獲得了成功。(6)目的基因必須整合到受體細胞的DNA中才能復(fù)制。(×)提示：目的基因沒有整合到受體細胞前可隨質(zhì)粒復(fù)制而復(fù)制。(7)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法實質(zhì)是將Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到宿主細胞的染色體上。(×)提示：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法實質(zhì)是將Ti質(zhì)粒上的T－DNA(含目的基因)轉(zhuǎn)移到宿主細胞的染色體上。(8)體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR技術(shù)都需要解旋酶打開DNA雙螺旋。(×)(9)DNA復(fù)制時，子鏈延伸的方向都是從5′端到3′端。(√)2．要合成有生物活性的胰島素，為什么受體細胞最好用單細胞真核生物？提示：胰島素是分泌蛋白，形成成熟的胰島素需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌，故最好選用真核生物如酵母菌作受體細胞。3．檢測棉花中導(dǎo)入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是什么？提示：通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲，來確定棉花抗蟲特性以及抗性的程度。4．自然界中生物的DNA復(fù)制和人工合成中的多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)之所以需要引物，是因為在DNA合成時DNA聚合酶只能__將游離的脫氧核苷酸連接到已有片段的3′端__合成子鏈。典題說法考向1基因表達載體的構(gòu)建(2023·常熟期中)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，其中TetR是四環(huán)素抗性基因、AmpR是氨芐青霉素抗性基因。圖2為重組質(zhì)粒，甲、乙、丙為3種引物所在的相應(yīng)位置。下列有關(guān)敘述正確的是(A)eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖1))eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖2))A．質(zhì)粒P1經(jīng)“酶處理”后平末端轉(zhuǎn)變成黏性末端，有利于與目的基因片段的連接B．質(zhì)粒P2和目的基因片段可在DNA聚合酶或DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒C．若受體微生物能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，說明成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒P3D．用PCR鑒定篩選出的菌落中是否含正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，選擇引物甲和丙最合適解析：質(zhì)粒P1經(jīng)“酶處理”后由平末端轉(zhuǎn)變成黏性末端，黏性末端游離，易于互補末端碰撞，因此能提高目的基因片段和質(zhì)粒的連接效率，A正確；質(zhì)粒P2和目的基因片段可在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒，這里不需要DNA聚合酶，B錯誤；圖示的質(zhì)粒均含有抗氨芐青霉素的基因，因此，若受體微生物能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，不能說明成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒P3，C錯誤；用PCR鑒定篩選出的菌落中是否含正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，選擇引物乙和丙即可，因為PCR擴增的DNA片段是引物之間的序列，擴增乙和丙之間的序列就包含了目的基因，D錯誤。(2023·如皋測試)人體內(nèi)的t－PA蛋白能高效降解由纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥，改造后的t－PA蛋白能顯著降低出血副作用。如圖表示構(gòu)建含t－PA改良基因重組質(zhì)粒的過程示意圖。相關(guān)說法錯誤的是(B)A．構(gòu)建重組質(zhì)粒時，選用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡB．需要DNA聚合酶將t－PA改良基因與質(zhì)粒連接C．新霉素抗性基因的作用是便于將導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來D．在加入新霉素的培養(yǎng)基中選擇呈白色的菌落選育工程菌株解析：根據(jù)圖中目的基因兩端的黏性末端以及各種限制酶的切割位點可知，在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，選用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割質(zhì)粒，才能與目的基因t－PA改良基因高效連接，A正確；將t－PA改良基因與質(zhì)粒連接的酶是DNA連接酶，不是DNA聚合酶，B錯誤；在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，其中的新霉素抗性基因沒有被破壞，因此可以根據(jù)對新霉素的抗性將成功導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來，C正確；重組質(zhì)粒已經(jīng)破壞了mlacZ基因，其不會表達產(chǎn)物，即細胞呈白色，所以，在加入新霉素的培養(yǎng)基中選擇呈白色的菌落選育工程菌株，D正確?？枷?基因工程的操作過程(2023·海安中學(xué))四尾柵藻生長周期短、適應(yīng)性強，是一種高潛力生物柴油新型原料，但油脂產(chǎn)量低。研究人員從含油量高的紫蘇中提取DGAT1(催化油脂合成的關(guān)鍵酶)基因，并成功導(dǎo)入四尾柵藻細胞內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)油四尾柵藻。其制備流程如圖所示，圖中AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，LacZ基因可使細菌利用培養(yǎng)基中的物質(zhì)X－gal進而使菌落呈現(xiàn)藍色，無該基因或該基因被破壞，菌落呈白色。請分析回答下列問題：(1)從含油量高的紫蘇組織細胞中提取總的RNA，在__逆轉(zhuǎn)錄__酶作用下獲得cDNA，用于PCR擴增，該過程的原理是按__堿基互補配對__原則合成cDNA。(2)PCR擴增DGAT1基因時，使反應(yīng)體系中的模板cDNA解旋為單鏈的條件是__加熱至90℃以上(約94℃)__。在DNA延伸的過程中，使用TaqDNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是__TaqDNA聚合酶熱穩(wěn)定性高而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下失活__。(3)圖中大腸桿菌是pMD19－DGAT1的理想的受體細胞，主要原因是__大腸桿菌繁殖快(或可以短時間產(chǎn)生大量質(zhì)粒)__。構(gòu)建的pMD19－DGAT1導(dǎo)入經(jīng)__CaCl2__溶液處理的感受態(tài)大腸桿菌細胞中，并接種到含__X－gal和氨芐青霉素__的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。一段時間后，挑選__白__色的菌落以提取質(zhì)粒pMD19－DGAT1。(4)用限制酶BamHⅠ和XbaⅠ切割pMD19－DGAT1和pBI121，將其連接成重組表達載體pBI121－DGAT1，并將其導(dǎo)入四尾柵藻細胞中。與單酶切相比，雙酶切的優(yōu)點有__BamHⅠ和XbaⅠ使DGAT1基因能定向插入表達載體__、__防止自身環(huán)化__。解析：(1)cDNA是逆轉(zhuǎn)錄獲得的，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對原則合成cDNA。PCR原理是DNA的復(fù)制，該過程遵循基因的互補配對原則。(2)酶大多是蛋白質(zhì)，都需要適宜的溫度發(fā)揮催化作用，普通的大腸桿菌的DNA聚合酶的最適合溫度基本不會超過40℃，但是在PCR反應(yīng)中，加熱的溫度會高達94℃，此時的普通DNA聚合酶會變性失活，無法使用，而TaqDNA聚合酶是耐熱的DNA聚合酶，可以使用。(3)大腸桿菌具有的特點是繁殖快、代謝旺盛、單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少，是理想的轉(zhuǎn)基因材料，構(gòu)建的PMD19－DGAT1導(dǎo)入經(jīng)CaCl2溶液處理的感受態(tài)大腸桿菌細胞中，含有LacZ基因的大腸桿菌可以利用培養(yǎng)物質(zhì)中的X－gal來使菌落呈現(xiàn)藍色，通過稀釋涂布平板法將大腸桿菌細胞接種到含氨芐青霉素和X－gal的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LacZ基因成功表達的菌落呈現(xiàn)藍色，成功導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌菌落呈現(xiàn)白色，故一段時間后，挑選白色的菌落以提取質(zhì)粒PMD19－DGAT1。(4)目的基因應(yīng)插入啟動子和終止子之間，據(jù)圖可知，兩者之間有BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點，所以采用BamHⅠ和XbaⅠ進行切割pMD19－DGAT1和pBI121。單酶切切割后的載體兩端的黏性末端相同，可能會導(dǎo)致目的基因和載體反向連接或載體、目的基因自身環(huán)化，采用雙切酶切割后的載體黏性末端不同，故可以控制外源基因插入方向，避免自身環(huán)化，提高重組效率。1．大腸桿菌的質(zhì)粒常被用來作基因工程中的載體，這與它的哪項優(yōu)點有關(guān)(D)A．具有黏性末端B．分子呈環(huán)狀，便于限制酶切割C．對宿主細胞的生存有決定性作用D．分子小，能自主復(fù)制，有標記基因解析：質(zhì)粒是環(huán)狀DNA分子，其不具有黏性末端；質(zhì)粒是一種獨立于細菌擬核外的環(huán)狀DNA分子，其中含有限制酶的切割位點時才能便于限制酶切割；質(zhì)粒對宿主細胞的生存沒有決定性作用；作為載體的質(zhì)粒分子小，能自主復(fù)制，且常含有標記基因，以便對重組后的重組DNA進行篩選。2．某線性DNA分子含有5000個堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的識別序列和切割位點如圖所示。下列說法錯誤的是(D)a酶切割產(chǎn)物(bp)b酶再次切割產(chǎn)物(bp)2100∶1400∶1000∶5001900∶200∶800∶600∶1000∶500A．在該DNA分子中，a酶與b酶的識別序列分別有3個和2個B．a(chǎn)酶與b酶切割后形成的黏性末端是相同的C．a(chǎn)酶與b酶切斷的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵D．若同時使用a酶和b酶，得到的結(jié)果和表中不同解析：a酶可以把原有DNA切成4段，說明有該DNA分子上有3個切口，即a酶的識別序列有3個；b酶把大小是2100bp的DNA切成大小分別為1900bp和200bp兩個片段，再把大小是1400bp的DNA切成大小分別為800bp和600bp兩個片段，說明b酶在該DNA分子上有2個切口，A正確。由圖可以看出，a酶和b酶切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，都為GATC—，B正確。a酶與b酶切斷的化學(xué)鍵均為連接兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，C正確。若同時使用a酶和b酶，a酶和b酶的酶切位點相同，故得到的結(jié)果和表中相同，D錯誤。3．重組質(zhì)?？梢詳y帶目的基因進入受體細胞，則下列不一定可以說明目的基因成功導(dǎo)入受體細胞的是(B)A．大腸桿菌中檢測到人胰島素基因的mRNAB．水稻細胞中檢測到氨芐青霉素抗性基因C．棉花細胞中檢測到抗棉鈴蟲基因D．鯉魚細胞中檢測到人的生長激素解析：氨芐青霉素抗性基因?qū)儆跇擞浕?，水稻細胞中檢測到氨芐青霉素抗性基因不能說明目的基因成功導(dǎo)入受體細胞，也可能導(dǎo)入了空載體。4．(2023·淮安期中)在基因工程中，常采用花粉管通道法和土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛毎Ｈ鐖D為花粉管通道法的一般原理示意圖。相關(guān)敘述正確的是(C)A．外源DNA進入胚囊最終獲得的種子均含有目的基因B．植物生長各個時期均可通過花粉管通道導(dǎo)入外源DNAC．花粉管通道法最大的優(yōu)點是無需植物組織培養(yǎng)，技術(shù)簡單D．含外源DNA的種子發(fā)育成植株后均具有相應(yīng)性狀解析：外源DNA進入胚囊，不一定能整合到染色體上，故最終獲得的種子不一定含有目的基因，A錯誤；圖示花粉管通道法應(yīng)在雌蕊成熟時進行操作，B錯誤；花粉管通道法可以直接實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的自然生成，無需經(jīng)過植物組織培養(yǎng)這一過程，C正確；含外源DNA的種子發(fā)育成植株不一定具有相應(yīng)性狀，還需進行個體生物學(xué)水平等的檢測，D錯誤。5．(多選)下列關(guān)于基因工程技術(shù)的敘述，錯誤的是(ABC)A．切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均特異性地識別6個核苷酸序列B．PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)C．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因D．抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體上也未必能正常表達解析：限制性內(nèi)切核酸酶大多能特異性識別6個核苷酸序列，但也有識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成，A錯誤；PCR中耐高溫的DNA聚合酶只是在延伸階段發(fā)揮催化作用，B錯誤；載體質(zhì)粒上抗生素抗性基因可作為標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇，而不是抗生素合成基因，C錯誤；目的基因?qū)肓耸荏w細胞不一定就都能正常表達，D正確。配套精練一、單項選擇題1．(2023·蘇州期中)下列關(guān)于基因工程基本工具的敘述，正確的是(C)A．限制性內(nèi)切核酸酶能夠識別新冠病毒特定的核苷酸序列并在特定位點切開磷酸二酯鍵B．EcoRⅠ識別序列和切割位點為G↓AATTC，則形成的黏性末端為AATTC—C．與DNA聚合酶不同，DNA連接酶發(fā)揮作用時不需要DNA模板D．用作分子運輸車的質(zhì)粒常有特殊的抗生素合成基因，便于重組DNA分子的篩選解析：限制性內(nèi)切核酸酶只能識別DNA，而新冠病毒的核酸是RNA，A錯誤；EcoRⅠ識別序列為GAATTC，切割點是G和A之間的磷酸二酯鍵，DNA的兩條鏈都是這樣切割，所以形成的黏性末端為AATT，B錯誤；與DNA聚合酶不同，DNA連接酶發(fā)揮作用時不需要DNA模板，C正確；用作分子運輸車的質(zhì)粒常有特殊的抗生素抗性基因，便于重組DNA分子的篩選，D錯誤。2．(2024·淮安調(diào)研)基因工程中需使用多種工具酶，幾種限制酶的切割位點如圖所示。下列說法正確的是(B)A．限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可以通過E．coliDNA連接酶相互連接B．DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成C．限制酶EcoRⅠ進行一次切割，會切斷2個磷酸二酯鍵，形成1個游離的5′末端D．若兩種限制酶的識別序列相同，則形成的末端一定能通過DNA連接酶相互連接解析：限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E．coliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，但連接效率較低，A錯誤；DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵，RNA聚合酶將單個核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵，B正確；一個限制酶切割一次，使DNA雙鏈斷開，會有兩個磷酸二酯鍵斷裂，形成2個黏性末端或平末端，形成2個游離的5′末端，C錯誤；若兩種限制酶的識別序列相同，但由于識別的位點不同，切割形成的末端不同，故不一定能通過DNA連接酶相互連接，D錯誤。3．下列有關(guān)重組DNA技術(shù)的基本工具的敘述，正確的是(B)A．限制酶能夠識別RNA分子的特定核苷酸序列B．?dāng)y帶外源DNA片段的質(zhì)?？稍谑荏w細胞中進行復(fù)制C．DNA連接酶不能連接雙鏈DNA片段的平末端D．DNA連接酶能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵解析：限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定的堿基之間切開磷酸二酯鍵，A錯誤；攜帶外源DNA片段的質(zhì)?？稍谑荏w細胞中進行復(fù)制，質(zhì)?？梢宰鳛槟康幕虻妮d體，B正確；T4DNA連接酶能連接雙鏈DNA片段的平末端，C錯誤；DNA連接酶能夠連接雙鏈DNA片段，形成磷酸二酯鍵，氫鍵自動生成，D錯誤。4．用EcoRⅠ和HindⅢ兩種限制酶處理同一DNA片段(限制酶在對應(yīng)切點一定能切開)，酶切位點及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖所示。下列相關(guān)敘述錯誤的是(B)eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖1))eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖2))A．圖1中兩種限制酶識別的脫氧核苷酸序列不同B．圖1中的兩種限制酶與解旋酶均可作用于氫鍵C．圖2中的泳道1可能是HindⅢ作用后得到的酶切產(chǎn)物D．若同時用EcoRⅠ和HindⅢ處理該DNA，電泳后得到4種產(chǎn)物解析：圖1中含有2個HindⅢ酶切位點，可以得到3段酶切產(chǎn)物，因此圖2中1條帶可能為HindⅢ酶切的結(jié)果，2條帶可能為EcoRⅠ酶切的結(jié)果，兩種限制酶識別的脫氧核苷酸序列不同，A、C正確；限制酶破壞的是磷酸二酯鍵，解旋酶破壞的是氫鍵，B錯誤；據(jù)圖1可見，若同時用EcoRⅠ和HindⅢ處理該DNA，電泳后得到4個不同的DNA片段，即4種產(chǎn)物，D正確。5．(2023·重慶卷)某小組通過PCR(假設(shè)引物長度為8個堿基短于實際長度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切(下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是(B)eq\a\vs4\al(,)A．其中一個引物序列為5′－TGCGCAGT－3′B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC．用步驟①的酶對載體進行酶切，至少獲得了2個片段D．酶切片段和載體連接時，可使用E．coliDNA連接酶或T4DNA連接酶解析：由于引物只能引導(dǎo)子鏈從5′到3′，根據(jù)堿基互補配對原則，其中一個引物序列為5′－TGCGCAGT－3′，另一個引物序列為5′－AGCTAGCA－3′，A正確；根據(jù)三種酶的酶切位點，左側(cè)的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右邊的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B錯誤；步驟①用到兩種限制酶切割，這兩種限制酶的識別序列不同，載體一般為環(huán)狀，且載體中至少含有1個限制酶NheⅠ的識別序列，至少有1個CfoⅠ的識別序列，因此用步驟①的酶對載體進行酶切，至少獲得了2個片段，C正確；圖中形成的是黏性末端，而E．coliDNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端，D正確。6．如表為四種限制酶所識別的核苷酸序列及相應(yīng)的切割位置(箭頭所指)，下列敘述正確的是(C)限制酶種類序列及切點①EcoRⅠ5′－G↓AATTC－3′3′－CTTAA↑G－5′②BamHⅠ5′－G↓GATCC－3′3′－CCTAG↑G－5′③BglⅡ5′－A↓GATCT－3′3′－TCTAG↑A－5′④NotⅠ5′－GC↓GGCCGC－3′3′－CGCCGG↑CG－3′A．①②③④可催化磷酸二酯鍵和氫鍵斷裂，形成黏性末端B．①切出的DNA片段，只有用E．coli連接酶才能連接起來C．②③切出的末端連接后形成的片段，不能再被②或③識別切割D．構(gòu)建基因表達載體時，用②③進行雙酶切，可防止目的基因與載體的反向連接解析：①②③④均為限制酶，它們可催化磷酸二酯鍵斷裂，但不能催化氫鍵斷裂，且均形成黏性末端，A錯誤；①切出的DNA片段帶有黏性末端，用E．coliDAN連接酶和T4DNA連接酶均能連接起來，B錯誤；②③切出的黏性末端相同，用DNA連接酶連接后形成的片段的堿基序列為eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(5′－GGATCT－3′,3′－CCTAGA－5′))，不能再被②或③識別切割，C正確；構(gòu)建基因表達載體時，用②③進行雙酶切，不能防止目的基因與載體的反向連接，因為這兩種限制酶切出的黏性末端是相同的，D錯誤。7．下列關(guān)于限制酶和DNA連接酶的敘述，正確的是(B)A．兩者都是從原核生物中分離純化出來的B．兩者的催化都會導(dǎo)致磷酸二酯鍵數(shù)目的改變C．限制酶都能在特定位點切割產(chǎn)生黏性末端D．DNA連接酶與DNA聚合酶作用的底物是相同的解析：限制酶主要來自原核生物，DNA連接酶來自大腸桿菌和噬菌體，A錯誤；兩者的催化都會導(dǎo)致磷酸二酯鍵數(shù)目的改變，限制酶使磷酸二酯鍵數(shù)目減少，DNA連接酶使磷酸二酯鍵數(shù)目增多，B正確；限制酶都能在特定位點切割產(chǎn)生黏性末端或平末端，C錯誤；DNA連接酶與DNA聚合酶作用的底物不同，前者是兩個DNA片段，后者是單個脫氧核苷酸，D錯誤。8．為獲得突變體，科研人員通常將T－DNA插入野生型個體的某些基因中(如圖)。使用PCR技術(shù)確定T－DNA的插入位置，應(yīng)選擇的引物組合是(C)A．引物1和引物3 B．引物1和引物2C．引物2和引物3 D．以上均不適合解析：引物3延伸的方向向左，引物1和引物2引物延伸的方向向右，引物組合只能是1和3，或2和3，完整的T－DNA過大，不能完成PCR，故選引物2和3。9．如圖表示PCR過程中某個階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是(D)A．②鏈從L到R的方向為3′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板B．PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制C．以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個引物③D．物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物解析：根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行關(guān)系可判斷，②鏈從L到R的方向為5′→3′，圖中①②鏈均可作為子鏈合成的模板，A錯誤；PCR過程需要通過高溫處理使雙鏈中氫鍵斷裂成為單鏈，而后通過降溫使子鏈和引物之間形成雙鏈結(jié)構(gòu)，而后調(diào)節(jié)溫度使子鏈沿著引物的3′端延伸，B錯誤；以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23＝8，則需消耗引物③的數(shù)目為2n+1－2＝24－2＝14個，C錯誤；物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得以該序列為模板合成的雙鏈DNA產(chǎn)物，D正確。10．癌癥患者進行化療或放療之后，體內(nèi)白細胞數(shù)量大幅度降低，可以注射粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(GM－CSF)增加白細胞的數(shù)量。在自然條件下，此細胞因子的含量很低，很難獲得。某科研團隊將人的GM－CSF基因?qū)氪竽c桿菌，大量生產(chǎn)重組GM－CSF，滿足了臨床需求。下列有關(guān)敘述正確的是(A)A．可通過PCR的方法獲取GM－CSF基因B．構(gòu)建GM－CSF基因表達載體需要限制酶和DNA聚合酶C．基因表達載體上的復(fù)制原點可以調(diào)控GM－CSF基因的表達D．可通過顯微注射的方式將GM－CSF基因?qū)氪竽c桿菌解析：人的GM－CSF基因可以從人的基因文庫中獲得，或從表達GM－CSF基因的細胞中提取相應(yīng)的mRNA再逆轉(zhuǎn)錄獲得，或PCR技術(shù)擴增獲得，或人工化學(xué)合成獲得，A正確；構(gòu)建GM－CSF基因表達載體需要限制酶和DNA連接酶，DNA復(fù)制時需要DNA聚合酶，B錯誤；基因表達載體上的復(fù)制原點可以啟動復(fù)制過程，啟動子和終止子可以調(diào)控GM－CSF基因的表達，C錯誤；將目的基因?qū)胧荏w細胞，根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣，將目的基因?qū)雱游锛毎钣行У姆椒ㄊ秋@微注射法，將目的基因?qū)胛⑸锛毎姆椒ㄊ歉惺軕B(tài)細胞法，D錯誤。二、多項選擇題11．下表為常用的限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷，以下說法正確的是(ABC)限制酶名稱識別序列和切割位點限制酶名稱識別序列和切割位點BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGGA．HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B．Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部C．BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D．一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列解析：HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端，A正確；限制酶的切割位點可能在序列內(nèi)部，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、HindⅡ、SmaⅠ，也可能在序列外部，如Sau3AⅠ，B正確；不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3AⅠ，C正確；HindⅡ可以識別多種核苷酸序列，D錯誤。12．自然界中很少出現(xiàn)藍色的花，天然藍色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍色。我國科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達載體(如圖)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中，在細胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍。下列相關(guān)敘述錯誤的是(BC)注：PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ為不同限制酶。A．上述獲得藍色玫瑰的方案中無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因B．將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠC．sfp和idgS基因表達時以DNA的同一條鏈為模板進行轉(zhuǎn)錄D．農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到白玫瑰染色體DNA上解析：根據(jù)題意，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將鏈霉菌的靛藍合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)導(dǎo)入白玫瑰后，在細胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍，所以無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，則會將終止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B錯誤；sfp和idgS基因具有各自的啟動子，其轉(zhuǎn)錄的方向不同，因此，sfp和idgS基因表達時以DNA的兩條鏈為模板進行轉(zhuǎn)錄，C錯誤；將目的基因?qū)胫参锛毎刹捎棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，故農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到白玫瑰染色體DNA上，D正確。13．(2023·揚州中學(xué))基因工程是一種DNA操作技術(shù)，其表達載體的構(gòu)建和檢測篩選是兩個重要步驟。圖1為某種質(zhì)粒簡圖，箭頭所指分別為限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點。已知目的基因X的兩端分別有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在內(nèi)的多種酶的酶切位點。圖2表示運用影印培養(yǎng)法(指在一系列平板培養(yǎng)基的相同位置上接種并培養(yǎng)出相同菌落的一種微生物培養(yǎng)方法)檢測表達載體是否導(dǎo)入大腸桿菌。下列有關(guān)敘述錯誤的是(CD)eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖1))eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖2))A．同時使用EcoRⅠ和BamHⅠ切割質(zhì)粒，可避免酶切后質(zhì)粒的自身環(huán)化B．轉(zhuǎn)化方法是將質(zhì)粒表達載體溶于緩沖液后與經(jīng)Ca2+處理的大腸桿菌混合C．培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別含有四環(huán)素和青霉素D．從篩選結(jié)果分析，含目的基因X的菌落是1、2、3、5解析：為避免酶切后質(zhì)粒的自身環(huán)化，可同時使用EcoRⅠ和BamHⅠ切割質(zhì)粒，A正確；轉(zhuǎn)化方法是將質(zhì)粒表達載體溶于緩沖液后與經(jīng)Ca2+處理的大腸桿菌混合，B正確；用EcoRⅠ和BamHⅠ兩種限制酶對質(zhì)粒進行切割時，會破壞四環(huán)素抗性基因，但不會破壞青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能在含有青霉素的培養(yǎng)基上生存，但不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存，導(dǎo)入空白質(zhì)粒的大腸桿菌在含有青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上均能生存，未導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌在含青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上均不能生存，所以培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別含有青霉素、四環(huán)素，含目的基因X的菌落是4和6，C、D錯誤。三、非選擇題14．(2023·南京江寧期末改編)干燥綜合征(SS)是一種自身免疫病，患者血清中存在多種抗體，其中SSB抗體特異性最強?？蒲腥藛T為生產(chǎn)SSB抗體的檢測試劑，利用基因工程獲得重組SSB蛋白，流程如下，請回答：注：XhoⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ表示限制酶，Kanr、cat分別表示卡那霉素抗性基因和氯霉素抗性基因。(1)為與PET41a質(zhì)粒連接，獲得的目的基因A兩端要含有__BamHⅠ和XhoⅠ__(寫出限制酶名稱)酶切位點。DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是__磷酸二酯鍵__。(2)獲得含SSB基因的重組質(zhì)粒后，進行如下實驗切割原質(zhì)粒和重組質(zhì)粒，獲得片段大小見表格(1kb＝1000堿基對)，分析數(shù)據(jù)，計算可得SSB基因的長度為__3kb__。與人基因組文庫中的SSB基因相比，通過①過程獲得的SSB基因結(jié)構(gòu)特點__無__(選填“有”或“無”)啟動子、終止子和內(nèi)含子等非編碼序列。限制酶EcoRⅠBamHⅠ和XhoⅠ原質(zhì)粒8.1kb2.7kb、5.4kb重組質(zhì)粒3.4kb、5.0kb未做該處理(3)②過程目的是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入用__Ca2+__處理過的大腸桿菌內(nèi)，并接種于添加__卡那霉素__的培養(yǎng)基上，收集菌落進行鑒定，將陽性菌落進一步純化后再將菌體破碎處理，篩選得到重組SSB蛋白。解析：(1)據(jù)圖可知，質(zhì)粒中存在限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ和XhoⅠ識別序列，因為目的基因中存在限制酶EcoRⅠ識別序列，因此不能用限制酶EcoRⅠ切割，因此質(zhì)粒只能用BamHⅠ和XhoⅠ切割。DNA連接酶將DNA片段進行連接，