分子生物學(xué)常用技術(shù)及其應(yīng)用課件

分子生物學(xué)常用技術(shù)及其應(yīng)用

分子生物學(xué)常用技術(shù)及其應(yīng)用第一節(jié)基因工程一基因工程的基本概念DNA重組——不同來源的DNA分子通過末端共價連接而形成重新組合的DNA分子的過程。基因工程——采用人工方法將不同來源的DNA進行重組，并將重組后的DNA引入宿主細胞中進行增殖或表達的過程。生物技術(shù)——包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、、細胞工程。克隆——通過無性繁殖所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。二、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶：能從中間有選擇性地切割DNA分子特異序列。DNA連接酶DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶多核苷酸激酶堿性磷酸酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶三、載體載體必須符合以下幾點要求：（1）能在宿主細胞內(nèi)復(fù)制并具有較高的拷貝數(shù)（2）容易進入宿主細胞（3）具有多個限制性核酸內(nèi)切酶單一的酶切位點（4）容易從宿主細胞中分離純化（5）有容易被識別篩選的標志常用的載體包括：質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒、病毒由質(zhì)粒與λ噬菌體構(gòu)成四、重組DNA技術(shù)的基本原理制備DNA片段，并通過載體將其導(dǎo)入受體細胞，在受體細胞中復(fù)制、擴增，以獲得單一DNA分子的大量拷貝。五、重組DNA技術(shù)的基本過程（一）制備目的基因和載體；（二）DNA的重組；（三）重組DNA導(dǎo)入宿主細胞（四）DNA重組體的篩選和鑒定（五）DNA重組體的擴增和表達（一）目的基因的制備：目的基因的篩選和分離可采用以下方法進行：1．直接從染色體DNA中分離：僅適用于原核生物基因的分離，較少采用。

2．人工合成：根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。

3．從mRNA合成cDNA：采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法通常可得到可表達的完整基因。

4．從基因文庫中篩選：將某一種基因DNA用適當?shù)南拗泼盖袛嗪螅c載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(genomicDNAlibrary)。將某種細胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部表達基因的種群，稱為C-文庫(cDNAlibrary)。C-文庫具有組織細胞特異性。

5．利用PCR合成：(聚合酶鏈反應(yīng)）如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因?；蛑委煛敢哉；虺C正、替代缺陷基因，或從基因水平調(diào)控細胞中缺陷基因的表達的一種治療疾病的方法。第四節(jié)DNA芯片技術(shù)綜合了分子生物學(xué)、微電子學(xué)、微加工和計算機等學(xué)科知識一對特異性寡核苷酸引物，dNTPs二、DNA芯片技術(shù)的基本原理與方法Northern印跡雜交包括CaCl2制備感受態(tài)宿主細胞、法電穿孔法、顯微注射法、基因槍法等常用的方法：包括核酸分子雜交、PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測、限制性內(nèi)切酶酶譜分析、DNA序列測定、DNA芯片技術(shù)非放射性標記物：生物素、地高辛、熒光素、酶實性材料需要進行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團，并在表面用光敏材料保護。載體必須符合以下幾點要求：3．從mRNA合成cDNA：（一）制備目的基因和載體；目的基因或DNA片段的技術(shù)。正常人有2個片段，191和103bp，（二）目的基因與載體連接(DNA的重組）

主要通過DNA連接酶和雙鏈DNA粘性末端序列互補結(jié)合。1、粘性末端連接利用同種限制性內(nèi)切酶切開載體和DNA分子，能產(chǎn)生相同的粘性末端，在T4連接酶作用下遍可互補。2、同聚物加尾連接在酶的催化下人為在DNA鏈3‘末端添加多聚脫氧單核苷酸，制造粘性末端。3、平末端連接在T4DNA連接酶的作用下，直接連接DNA平端末端，效率較低。4、人工接頭連接在平端DNA末尾加上人工合成的具有限制性DNA內(nèi)切酶的DNA片段，再用內(nèi)切酶作用產(chǎn)生粘性末端。（三）將外源性DNA導(dǎo)入宿主細胞常用的方法兩種：1、轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化——指將質(zhì)?；蚱渌庠葱訢NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。包括CaCl2制備感受態(tài)宿主細胞、法電穿孔法、顯微注射法、基因槍法等2、感染感染——以噬菌體進入宿主細胞或病毒進入宿主細胞中繁殖的過程。用滅活的噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)外殼包裹重組的DNA分子，使其進如宿主細胞。（四）目的基因的篩選和鑒定常用的方法包括：遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR、核苷酸序列測定、DNA限制內(nèi)切酶圖譜分析法等。遺傳學(xué)法：載體經(jīng)常帶有抗藥基因，利用含有該藥物的培養(yǎng)基直接分離。分子雜交法：利用32P標記的探針與被檢對象進行雜交鑒定。免疫學(xué)法：利用特異性抗體與基因表達產(chǎn)物結(jié)合的方法。（五）克隆基因的表達不同的目的基因在真核和原核表達體系中表達結(jié)果不同。真核細胞可用于表達原核基因原核細胞表達的真核基因產(chǎn)物還需要進一步加工處理，如甲基化、糖基化、折疊六、基因工程在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究疾病的診斷和基因治療生產(chǎn)基因工程藥物：既可改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)，提高產(chǎn)量，也可用于新蛋白類藥物的生產(chǎn)。制造轉(zhuǎn)基因動物：可用于藥物蛋白生產(chǎn)、器官移植人類基因工程組計劃蛋白質(zhì)工程：通過基因工程改變蛋白質(zhì)第二節(jié)核酸的分子雜交核酸分子雜交——依據(jù)兩條單核苷酸鏈之間的堿基互補、變性和復(fù)性的原理，用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針，檢測待測樣品中是否存在與其互補的同源核苷酸序列的方法。一、核酸分子雜交的基本原理探針核酸分子與變性的被檢核酸分子復(fù)性，通過堿基互補的原則，形成雜交分子。探針必須帶有標記，可用于定性和定量分析（二）核酸分子雜交的基本方法Southern印跡雜交待測核酸是DNA片段，是DNA與DNA雜交，指將酶切并經(jīng)電泳分離的DNA片段固定在載體上，與探針進行雜交。Northern印跡雜交待測核酸是RNA片段，指將待測RNA經(jīng)分離后固定在載體上，與探針進行雜交。斑點及狹縫印跡雜交直接將變性核酸固定在載體上，用探針進行雜交。優(yōu)點是一張膜同時可用多種不同探針檢測原位雜交直接用探針和細胞內(nèi)的核酸進行雜交三、探針的特征（一）探針的特征1、要帶有標記物2、應(yīng)是單鏈3、具有高度的特異性4、探針長段不一，短探針雜交速率快且特異性強5、標記的探針應(yīng)具有高度的靈敏性、穩(wěn)定、標記方法簡便、安全（二）探針的種類與制備1、基因組DNA探針——直接從基因組分離2、cDNA探針——通過逆轉(zhuǎn)錄生成3、寡核苷酸探針——人工聚合成4、RNA探針——轉(zhuǎn)錄生成（三）探針的標記物放射性標記物：32P、35S、3H、125I、131I非放射性標記物：生物素、地高辛、熒光素、酶（四）標記方法體內(nèi)標記法：將標記物摻入培養(yǎng)基體外標記法：化學(xué)法或酶法第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)

polymerasechainreaction聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

——體外高效、快速、特異地擴增目的基因或DNA片段的技術(shù)。一、PCR的基本原理其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間等，使目的DNA得以迅速擴增DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：模板DNA（基因組DNA），隨機小分子RNA引物，dNTPs酶：DNA聚合酶，解旋酶，引發(fā)酶反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，37℃反應(yīng)過程：模板DNA解旋、引發(fā)體的形成、延長（三階段）產(chǎn)物：模板DNA（基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍

原料：模板DNA（基因組DNA，cDNA）一對特異性寡核苷酸引物，dNTPs酶：TaqDNA聚合酶反應(yīng)條件：合適的緩沖液，三種變化的溫度（94，50-70，72℃），一定的循環(huán)數(shù)（25-35）反應(yīng)過程：DNA模板變性（解鏈）、模板與引物退火、引物延伸（三階段，多循環(huán)）產(chǎn)物：目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍.PCR包括制備探針、打印、探針固化三個步驟（一）制備目的基因和載體；新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。在正常的反應(yīng)條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，就會出現(xiàn)平臺效應(yīng)(Plateau)，產(chǎn)物的量不再增加。（一）制備目的基因和載體；（五）DNA重組體的擴增和表達生物技術(shù)——包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、、細胞工程。（五）DNA重組體的擴增和表達以mRNA為原始模板的PCR，亦稱逆轉(zhuǎn)錄PCR。以mRNA為原始模板的PCR，亦稱逆轉(zhuǎn)錄PCR。一、PCR的基本原理3、適溫延伸（72℃）分子生物學(xué)常用技術(shù)及其應(yīng)用載體必須符合以下幾點要求：真核細胞可用于表達原核基因二、過程（經(jīng)典操作過程）

1、高溫變性（DNA模板變性）與體內(nèi)DNA解鏈過程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過95℃左右的高溫使其發(fā)生變性，形成單鏈DNA

2、低溫退火（模板與引物退火）

PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時的引物（primer）,這兩個引物分別與待擴增模板DNA的目標片段兩端的序列互補。在降低溫度的過程中（一般為70-75℃，通過控制退火條件，引物就能準確地與擴增區(qū)域的兩端配對。primers⑴引物短，不易纏繞；⑵設(shè)計的引物是與模板DNA兩端序列互補；⑶引物的量遠大于模板分子的量，引物與模板DNA形成雙鏈的幾率遠遠高于DNA分子自身的復(fù)性。

3、適溫延伸（72℃）在PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按堿基配對的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補的復(fù)制鏈。Taq酶dNTPS

新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。

熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)每一循環(huán)后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。理論上講，擴增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，即n個循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。而實際上，PCR的擴增倍數(shù)為（1+X）n，X為擴增效率，平均為75%熱變性-復(fù)性-延伸25-35次循環(huán)百萬倍擴增盡管PCR擴增DNA非常有效，但目的DNA序列的指數(shù)擴增并不是一個無限制的過程。在正常的反應(yīng)條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，就會出現(xiàn)平臺效應(yīng)

(Plateau)

，產(chǎn)物的量不再增加?！捌脚_效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度等多種因素。RT—PCR以mRNA為原始模板的PCR，亦稱逆轉(zhuǎn)錄PCR。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42℃進行，隨后將反應(yīng)混合物加熱至95℃5min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，取2ul反應(yīng)產(chǎn)物，按DNA為模板的PCR反應(yīng)步驟，進行擴增反應(yīng)。三、PCR在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

對人類遺傳信息的認識和研究基因工程藥物與疫苗生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物和植物制造基因診斷與基因治療鐮刀型紅細胞貧血Chehab等設(shè)計一對引物把含有突變的DNA片段（共294bp）擴增，擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶OxaNI消化，瓊脂糖凝膠電泳后染色觀察：正常人有2個片段，191和103bp，鐮刀狀紅細胞貧血的

純合子，僅有一個片段294bp

雜合子有191、103和294bp3個片段綜合了分子生物學(xué)、微電子學(xué)、微加工和計算機等學(xué)科知識本質(zhì)：在固定的玻片等載體上的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，芯片上每平方厘米可排列成千上萬生物分子，能快速準確地檢測核酸，并獲取樣品中的有關(guān)信息。第四節(jié)DNA芯片技術(shù)一、DNA芯片技術(shù)的概念和主要類型DNA芯片技術(shù)——指將大量已知寡核苷酸或DNA探針（不標記）按特定的排列方式固化在固相支持物（多用計算機硅芯片）表面，按堿基互補配對的原則，與標記的特異的單鏈DNA或RNA（待測樣品）分子雜交形成雙鏈，通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品分子的數(shù)量和序列信息。DNA芯片主要類型原位合成芯片才用光介導(dǎo)和壓電打印等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片DNA微集陣列將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片DNA重組——不同來源的DNA分子通過末端共價連接而形成重新組合的DNA分子的過程。遺傳學(xué)法：載體經(jīng)常帶有抗藥基因，利用含有該藥物的培養(yǎng)基直接分離。載體必須符合以下幾點要求：三、DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用（自學(xué)）2、低溫退火（模板與引物退火）轉(zhuǎn)化——指將質(zhì)?；蚱渌庠葱訢NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。包括制備探針、打印、探針固化三個步驟隨機小分子RNA引物，dNTPs載體必須符合以下幾點要求：基因診斷與基因治療產(chǎn)物：目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍.在正常的反應(yīng)條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，就會出現(xiàn)平臺效應(yīng)(Plateau)，產(chǎn)物的量不再增加。1．直接從染色體DNA中分離：3．從mRNA合成cDNA：原料：模板DNA（基因組DNA），二、DNA芯片技術(shù)的基本原理與方法DNA芯片技術(shù)工作流程主要包括：芯片制備——關(guān)鍵樣品的準備與標記雜交信號檢測和數(shù)據(jù)分析處理（5）有容易被識別篩選的標志（5）有容易被識別篩選的標志原料：模板DNA（基因組DNA，cDNA）才用光介導(dǎo)和壓電打印等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片常用的方法：包括核酸分子雜交、PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測、限制性內(nèi)切酶酶譜分析、DNA序列測定、DNA芯片技術(shù)常用的方法包括：遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR、核苷酸序列測定、DNA限制內(nèi)切酶圖譜分析法等。載體必須符合以下幾點要求：基因治療——指以正常基因矯正、替代缺陷基因，或從基因水平調(diào)控細胞中缺陷基因的表達的一種治療疾病的方法?！捌脚_效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度等多種因素。DNA重組——不同來源的DNA分子通過末端共價連接而形成重新組合的DNA分子的過程。常用的方法包括：遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR、核苷酸序列測定、DNA限制內(nèi)切酶圖譜分析法等。免疫學(xué)法：利用特異性抗體與基因表達產(chǎn)物結(jié)合的方法。遺傳學(xué)法：載體經(jīng)常