第三章動物細胞工程制藥VIP

第一節(jié)概述

細胞工程：以細胞為單位，按人們的意志，應用細胞生物學、分子生物學等理論和技術(shù)，有目的的進行精心設(shè)計、精心操作，使細胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進行大量培養(yǎng)、增殖，并提取對人類有用的產(chǎn)品的一門科學。當前1頁，共99頁，星期日。細胞工程是一門應用科學和工程技術(shù)，具體包括：

真核細胞的基因重組、導入、擴增和表達的理論和技術(shù)

細胞融合的理論和技術(shù)

細胞器特別是細胞核抑制的理論和技術(shù)

染色體改造的理論和技術(shù)

轉(zhuǎn)基因動植物的理論和技術(shù)

細胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)

有關(guān)產(chǎn)物提取純化的理論和技術(shù)當前2頁，共99頁，星期日。第二節(jié)動物細胞的形態(tài)和生理特性

離體培養(yǎng)的細胞可分為兩類：貼壁依賴型細胞和貼壁非依賴型細胞，前者可簡稱為貼壁細胞，后者簡稱為懸浮細胞。動物細胞高度分化。一、動物細胞的形態(tài)當前3頁，共99頁，星期日。1.貼壁細胞

貼壁細胞必須有可以貼附的支持物表面，細胞依靠自身分泌的或者培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長、增殖。當前4頁，共99頁，星期日。貼壁細胞在表面生長后一般形成兩種形態(tài)——纖維樣細胞和上皮樣細胞。纖維樣細胞：主要來自中胚層組織的細胞（成纖維細胞、心肌細胞、成骨細胞、平滑肌細胞）上皮樣細胞主要外胚層和內(nèi)胚層的組織細胞（皮膚細胞、腸管上皮細胞和肺泡上皮細胞等）當前5頁，共99頁，星期日。2.懸浮細胞

懸浮細胞的生長不依賴支持物表面，可以在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長（血液中的淋巴細胞、Namalwacell）3.兼性貼壁細胞

既可以貼附于支持物表面生長，在一定的條件下，也可以在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)良好地生長。當前6頁，共99頁，星期日。二、動物細胞的分化組成和代謝1.動物細胞的化學組成

水、無機鹽、蛋白質(zhì)、糖、脂類和核酸組成。

細胞中水占絕大多數(shù)，占細胞鮮重的85%-95%，無機鹽占1.5%，蛋白質(zhì)占7%-10%，脂類占1%-2%，其他物質(zhì)占1.5%。當前7頁，共99頁，星期日。2.動物細胞的代謝

糖、脂、蛋白質(zhì)等有機物大分子的代謝一般都可以分成三個降解階段：①生物大分子降解為小分子；②小分子物質(zhì)進一步代謝轉(zhuǎn)化為三個主要的中間產(chǎn)物——乙酰輔酶A、α-酮戊二酸和草酰乙酸；③三種中間產(chǎn)物進入TCA循環(huán)，為動物的生命活動供能。當前8頁，共99頁，星期日。（2）加入消化液適量，以搖動時能蓋滿單層細胞為宜；浸泡有利于蛋白質(zhì)和殘留細胞等污垢的清除，常用3%磷酸三鈉溶液，也可用一些常見的洗液；常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA、或胰酶-EDTA聯(lián)用及胰酶-檸檬酸鹽。③可實現(xiàn)高密度細胞培養(yǎng)、使高產(chǎn)量細胞長時間停留在反應器中、優(yōu)化細胞生長與產(chǎn)物合成的環(huán)境等細胞培養(yǎng)的要求。固定床或流化床式生物反應器等。實驗室規(guī)?！?0L如果控制系統(tǒng)不受污染，能長期運轉(zhuǎn)。（1） 微載體培養(yǎng)，利用小顆粒載體使貼壁細胞附著其上培養(yǎng)增殖，而載體體積小、比重輕，在輕度攪拌下就可攜帶附著其上的細胞懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點，又能提高細胞密度。當前49頁，共99頁，星期日。（4）終止消化要先去掉消化液，再加入含血清的培養(yǎng)基；分泌量大、容易轉(zhuǎn)染、易生長、可以在無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮培養(yǎng)，而且能對蛋白進行糖基化修飾，表達機制明確。讓細胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法，適用于一切貼壁依賴性細胞，也適用于兼性貼壁細胞。當前25頁，共99頁，星期日。當前54頁，共99頁，星期日。③供應充足、穩(wěn)定；

在氧氣供應不足或者劇烈運動造成的局部缺氧時，動物細胞可以進行無氧呼吸——糖酵解供能。

在動物細胞的體外培養(yǎng)中，供能物質(zhì)主要是葡萄糖和谷氨酰胺。當前9頁，共99頁，星期日。三、動物細胞特點1.細胞的分裂周期長同細菌、酵母比較不同種屬、同種屬不同組織比較2.細胞生長需貼附基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象（密度依賴抑制）二倍體特有。當前10頁，共99頁，星期日。3.正常細胞的生長壽命是有限的細胞從離體培養(yǎng)開始，我們稱之為原代培養(yǎng)，隨后細胞經(jīng)過傳代后，即成為有限細胞系。

細胞經(jīng)過一些人為的或自然的因素轉(zhuǎn)化為異倍體后，細胞就可轉(zhuǎn)變?yōu)闊o限細胞系，或稱連續(xù)細胞系。這種細胞的壽命是無限的，適合工業(yè)化生產(chǎn)的需要。有癌變的特點，但并不是癌細胞；癌細胞可以通過無限增殖成為無限細胞系。當前11頁，共99頁，星期日。4.動物細胞對周圍環(huán)境敏感動物細胞有膜無壁。5.動物細胞對培養(yǎng)基的要求高

至少12種必需的氨基酸、8種以上的維生素、必要的無機鹽和微量元素、作為碳源的葡萄糖，還需要多種細胞生長因子和貼壁因子才能生長。

不同的細胞對培養(yǎng)基的要求也會有所不同。當前12頁，共99頁，星期日。6.動物細胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細菌不同動物蛋白合成場所：游離核糖體和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖體。游離核糖體：細胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)蛋白；糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合核糖體：分泌蛋白和膜中整合蛋白，修飾后成為糖蛋白。細菌：無糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。當前13頁，共99頁，星期日。利用動物細胞作為宿主細胞生產(chǎn)藥品優(yōu)勢：①蛋白多分泌到細胞外，易于收集和純化；②具有完善的翻譯后修飾系統(tǒng)，產(chǎn)物更接近天然，適用于臨床。利用動物細胞作為宿主細胞生產(chǎn)藥品缺點：

培養(yǎng)條件苛刻，成本高，產(chǎn)量低。當前14頁，共99頁，星期日。第三節(jié)生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動物細胞的要求

不是所有的動物細胞都可以用于生產(chǎn)人用的藥品。原代細胞→二倍體細胞→異倍體細胞

現(xiàn)在基本上已經(jīng)取消了生產(chǎn)用動物細胞必須用傳代細胞的限制，但是對最終產(chǎn)品中的DNA含量做了嚴格的要求。當前15頁，共99頁，星期日。二、生產(chǎn)用動物細胞的獲得

生產(chǎn)中的動物細胞有：原代細胞、二倍體細胞系、無限傳代細胞系和利用上述3種細胞進行融合和重組的工程細胞系。1.原代細胞直接取自動物組織、器官。當前16頁，共99頁，星期日。2.二倍體細胞系

原代細胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從多種細胞成分的組織中挑選并純化出具有某些特征的細胞株，這類細胞仍然是二倍體核型，具有貼壁依賴和接觸抑制特性，無致瘤性，一般從動物胚胎組織中獲取。當前17頁，共99頁，星期日。3.轉(zhuǎn)化細胞系異倍體細胞，沒有正常細胞的特點，可以無限增殖。自發(fā)形成：嚙齒動物。人工轉(zhuǎn)化：病毒或化學試劑。當前18頁，共99頁，星期日。4.融合細胞系

細胞融合是指兩個或兩個以上細胞合并成一個細胞的過程。誘導仙臺病毒和聚乙二醇（PEG）高壓電場的電融合當前19頁，共99頁，星期日。（1）仙臺病毒融合法①病毒加入兩種細胞后，4℃條件下，病毒附著在兩種細胞的細胞膜上，使兩種細胞互相凝聚。②在37℃條件下，病毒與細胞膜發(fā)生反應，細胞膜受到破壞；③兩個細胞的連接部位穿通，周邊連接部修復。④細胞融合。少用（感染困難、融合慢、去病毒困難）當前20頁，共99頁，星期日。（2）聚乙二醇融合法產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞的制備。（3）電融合法

利用電場進行人工誘導細胞融合，是利用細胞在短時間的電場作用下，細胞膜發(fā)生可逆性的電擊穿，而使相鄰的細胞的細胞膜相互發(fā)生繼發(fā)性融合。操作簡便、無化學毒性、對細胞損傷小、融合同步和融合率高，可在顯微鏡下直接觀察融合情況。當前21頁，共99頁，星期日。5.重組工程細胞系利用基因工程技術(shù)手段重組的各種細胞系。三、基因工程細胞的構(gòu)建和篩選1.真核細胞基因表達載體的構(gòu)建載體病毒載體質(zhì)粒載體腺病毒桿狀病毒當前22頁，共99頁，星期日。桿狀病毒作為載體的優(yōu)點：（1）桿狀病毒基因組是雙鏈DNA，容易進行重組；（2）可插入較大片段的外源表達基因，插入7-8kb外源基因而不影響正常病毒粒子的形成；（3）多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染能力的病毒粒子；（4）多角體蛋白基因有強啟動子，蛋白表達量較高；（5）多角體是一個明顯的標記物，可以直接用顯微鏡觀察，易于篩選陽性克?。唬?）如果是家蠶桿狀病毒作載體，可以直接在家蠶體內(nèi)進行外源基因表達。當前23頁，共99頁，星期日。2.基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選磷酸鈣沉淀法和電穿孔法。

磷酸鈣沉淀法是將溶解的DNA加在Na2HPO4溶液內(nèi)，再逐漸加入CaCl2溶液，當二者形成磷酸鈣沉淀時，DNA被包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當該沉淀與細胞表面接觸時，則通過細胞吞噬作用而將DNA導入其中。當前24頁，共99頁，星期日。

篩選已經(jīng)整合外源基因的工程細胞主要依靠構(gòu)建的載體內(nèi)的選擇標記來進行，篩選出的細胞要進行克隆和亞克隆使其純化，并利用其自身的擴增系統(tǒng)，不斷增加拷貝數(shù)，從而獲得高效表達的穩(wěn)定的工程細胞株。當前25頁，共99頁，星期日。四、常用生產(chǎn)用的細胞特性BHK-21細胞：從生長1天的幼鼠腎臟分離的經(jīng)13次克隆的成纖維樣細胞，核型2n=44，DMEM培養(yǎng)基添加7%牛血清培養(yǎng)，常被用于增殖病毒和制備疫苗，現(xiàn)也被用于工程細胞的構(gòu)建。C127細胞：來自RⅢ小鼠腫瘤細胞，適用于攜帶有牛乳頭瘤病毒的載體的轉(zhuǎn)染。當前26頁，共99頁，星期日。CHO-K1細胞：從鼠卵巢中分離的上皮樣細胞，核型2n=20~22，用DMEM培養(yǎng)基加0.1mmol/L次黃嘌呤和0.01mmol/L胸苷、10%小牛血清，并需額外添加脯氨酸。COS細胞：通過利用復制起點缺失的SV40病毒基因組DNA轉(zhuǎn)化非洲猴腎細胞CV-1獲得，是廣泛應用的瞬時表達系統(tǒng)。當前27頁，共99頁，星期日。MDCK細胞：從成年西班牙狗的腎臟分離的貼壁依賴型上皮樣細胞，能進行多種病毒的增殖，常被用來生產(chǎn)獸用疫苗。MRC-5細胞：從14周男胎肺組織獲得的成纖維樣二倍體細胞，核型2n=46，BME培養(yǎng)基加10%小牛血清培養(yǎng)。當前28頁，共99頁，星期日。Namalwa細胞：從肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的患者體內(nèi)獲取后構(gòu)建的一株人的類淋巴母細胞，該細胞是完全分化的B淋巴細胞，有2.8%的高倍體率，常用培養(yǎng)基為RPMI1640，需添加7%胎牛血清培養(yǎng)，外源蛋白表達水平很高。Sf-9細胞：從秋黏蟲的蛹卵組織中分離出親代細胞后克隆形成，對苜蓿尺蠖核型多角體蛋白病毒和其他的桿狀病毒高度敏感，利用Grace培養(yǎng)基添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液及10%胎牛血清培養(yǎng)。當前29頁，共99頁，星期日。Vero細胞：從正常的成年非洲猴腎中分離的貼壁依賴性成纖維細胞，核型2n=60，高倍體率1.7%，利用199培養(yǎng)基添加5%太牛血清培養(yǎng)，可支持多種病毒的增殖并制成疫苗。WI-38細胞：從女性高加索人的正常胚肺組織中獲得成纖維樣二倍體細胞，核型2n=46，利用BME培養(yǎng)基添加10%小牛血清培養(yǎng)。當前30頁，共99頁，星期日。鼠骨髓瘤細胞：具有很輕增殖能力的可以無限培養(yǎng)的細胞。分泌量大、容易轉(zhuǎn)染、易生長、可以在無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮培養(yǎng)，而且能對蛋白進行糖基化修飾，表達機制明確。SP2/0-Ag14細胞：從有抗羊紅細胞活性的BALB/c小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞系P3X63Ag8融合后形成的SP2/HL-Ag再亞克隆后分離獲得，常用DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清培養(yǎng)，廣泛的用于單克隆抗體雜交瘤細胞的制備和抗體的生產(chǎn)。當前31頁，共99頁，星期日。五、細胞庫的建立

用于生產(chǎn)的工程細胞必需建立兩個細胞庫：原始細胞庫（MCB)和生產(chǎn)用細胞庫（MWCB）（工作細胞庫,WCB）。

MCB的細胞應該是單一來源的均質(zhì)的細胞，二倍體細胞要盡量是群體倍增水平低的細胞。當前32頁，共99頁，星期日。MCB細胞檔案：

（1）該細胞的歷史——來源、動物年齡、性別、細胞分離的方法和所用的培養(yǎng)材料等。

（2）細胞的特性——形態(tài)、生長的特性、種源特性、重組細胞的載體構(gòu)建資料、基因拷貝數(shù)、表達產(chǎn)物的性質(zhì)和產(chǎn)量及穩(wěn)定性等。

（3）對各種有害因子檢查的結(jié)果——細菌、真菌、支原體和各種病毒，包括發(fā)轉(zhuǎn)錄病毒。當前33頁，共99頁，星期日。

WCB中的細胞應該是從某個MCB的單一來源或者多個多個安瓿瓶融合在一起的，然后培養(yǎng)擴增到一定數(shù)量后，再分裝貯存形成細胞庫。

WCB中的細胞也要建檔案，并且要進行無菌性和無細胞交叉污染的檢查。當前34頁，共99頁，星期日。第四節(jié)動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基保證細胞體外培養(yǎng)成功的基本條件：1.所有和細胞接觸的設(shè)備、器材和溶液，必須保證無菌，避免細胞外微生物的污染；2.營養(yǎng)供應必須充足，絕對不能有有害物質(zhì)，避免即使是極其微量的有害物質(zhì)的滲入；3.保證適量的氧氣供應；4.在培養(yǎng)過程中，隨時除去細胞代謝產(chǎn)生的有害產(chǎn)物；5.保證適宜細胞生長的良好的外界環(huán)境；6.及時分種，保持適當?shù)募毎芏?。當?5頁，共99頁，星期日。細胞培養(yǎng)的無菌操作二氧化碳細胞培養(yǎng)箱

當前36頁，共99頁，星期日。一、動物細胞培養(yǎng)的條件1.器材的清洗和消毒

細胞培養(yǎng)成功與否的重要因素之一就是培養(yǎng)細胞所用的器材和用具是否能做到徹底清洗和消毒。通過清洗和消毒去除影響細胞生長的有害物質(zhì)，防止外來微生物的污染。當前37頁，共99頁，星期日。（1）器材的清洗

一般來說，器材的清洗主要有浸泡、刷洗、泡酸和沖洗四個步驟，確保器材上沒有油跡和其他殘留物質(zhì)。

浸泡有利于蛋白質(zhì)和殘留細胞等污垢的清除，常用3%磷酸三鈉溶液，也可用一些常見的洗液；當前38頁，共99頁，星期日。

泡酸所用的酸有強酸和弱酸。

新的玻璃儀器第一次使用前一定要用弱酸（稀鹽酸）泡過，去除玻璃中的游離堿；

強酸常用重鉻酸鉀和硫酸配制，利用其強氧化性去除儀器上不易洗脫的污漬。

清洗干凈的玻璃儀器要用清水反復沖洗干凈，后分別用蒸餾水和去離子水沖洗。當前39頁，共99頁，星期日。（2）器材的消毒滅菌

常用的滅菌方式有物理消毒和化學消毒。物理方法有紫外線、干熱、濕熱和過濾等；化學方法即使用抗生素和各種化學消毒劑。當前40頁，共99頁，星期日。

抗生素的使用要慎重，長期對同細菌、病毒使用同一種抗生素，很容易產(chǎn)生抗藥性，而且抗藥性很難消除，另外，抗生素的使用會影響到所培養(yǎng)細胞的生理代謝和形態(tài)。在實際生產(chǎn)中，為了避免污染、提高效益，抗生素經(jīng)常使用，但是規(guī)定不得使用青霉素和β-內(nèi)酰胺類抗生素（革蘭氏陽性細菌）。實驗室中常加的是青霉素和鏈霉素，簡稱雙抗，防細胞污染。污染最多的是霉菌和真菌。當前41頁，共99頁，星期日。細胞復蘇總得要求是快融。當前85頁，共99頁，星期日。（2）細胞的特性——形態(tài)、生長的特性、種源特性、重組細胞的載體構(gòu)建資料、基因拷貝數(shù)、表達產(chǎn)物的性質(zhì)和產(chǎn)量及穩(wěn)定性等。利用電場進行人工誘導細胞融合，是利用細胞在短時間的電場作用下，細胞膜發(fā)生可逆性的電擊穿，而使相鄰的細胞的細胞膜相互發(fā)生繼發(fā)性融合。構(gòu)建抗細胞凋亡的工程細胞。細胞器特別是細胞核抑制的理論和技術(shù)當前4頁，共99頁，星期日。二、動物細胞的分化組成和代謝②宿主細胞殘留的DNA含量應小于100pg；二、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）一、動物細胞產(chǎn)品常用的純化方法篩選已經(jīng)整合外源基因的工程細胞主要依靠構(gòu)建的載體內(nèi)的選擇標記來進行，篩選出的細胞要進行克隆和亞克隆使其純化，并利用其自身的擴增系統(tǒng)，不斷增加拷貝數(shù)，從而獲得高效表達的穩(wěn)定的工程細胞株。無血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入一些添加劑，添加的物質(zhì)主要有：一、動物細胞產(chǎn)品常用的純化方法培養(yǎng)基的不同：液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)培養(yǎng)器皿多孔板細胞培養(yǎng)瓶當前42頁，共99頁，星期日。2.細胞培養(yǎng)的水質(zhì)

水質(zhì)的好壞直接影響細胞培養(yǎng)的成功與否。細胞培養(yǎng)的水必須進行特殊的處理，保證水中沒有有毒元素、過量的金屬離子和微生物污染。

蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖維過濾等單獨使用或配合使用，制備純水，一般要求金屬離子含量很低，電阻值在18M以上。動物細胞制藥用水，要求去熱源。當前43頁，共99頁，星期日。3.pH細胞量大時比細胞量小時對pH的耐受性強。

動物細胞培養(yǎng)的最適pH為7.2-7.4，低于6.8或者高于7.6都會對細胞培養(yǎng)產(chǎn)生明顯的不利影響。緩沖液系統(tǒng)，減少乳酸的影響。緩沖液：當往某些溶液中加入一定量的酸和堿時，有阻礙溶液pH變化的作用，稱為緩沖作用，這樣的溶液叫做緩沖溶液。弱酸及其鹽的混合溶液（如HAc與NaAc），弱堿及其鹽的混合溶液（如NH3·H2O與NH4Cl）等都是緩沖溶液。當前44頁，共99頁，星期日。4.滲透壓

動物細胞有膜無壁，對外界環(huán)境滲透壓的高低波動更敏感。原代細胞對滲透壓的耐受性要比傳代細胞差。

細胞培養(yǎng)理想的滲透壓為290-300

mOsm/kg。mOsm：毫滲摩爾，1升溶液中所含的非電解質(zhì)或電解質(zhì)的毫摩爾數(shù)。調(diào)整溶液的滲透壓常采用添加或減少NaCl的辦法。當前45頁，共99頁，星期日。5.溫度

溫度過高導致細胞退變甚至死亡，

溫度過低會降低細胞的代謝和生長速度，影響產(chǎn)物的含量。

哺乳動物細胞的最佳培養(yǎng)溫度是37±0.5℃

昆蟲細胞的最佳培養(yǎng)溫度為25-28℃退變：因理化或生物作用而逐步老化變質(zhì)直至損毀的過程。當前46頁，共99頁，星期日。6.空氣

在細胞培養(yǎng)過程中必須供給足量的氧氣，保證細胞進行能量代謝，減少培養(yǎng)過程中因為細胞糖酵解產(chǎn)生的乳酸積累，避免細胞的退變和死亡。

在利用方瓶或者轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時，只要保證培養(yǎng)液的體積不超過培養(yǎng)瓶溶劑的30%，就可以利用瓶內(nèi)空氣保證培養(yǎng)所需而不需要額外通氣；在采用生物反應器大量培養(yǎng)時，則必須專門通氣，補充氧量。當前47頁，共99頁，星期日。微生物細胞與動物細胞培養(yǎng)方法的比較性質(zhì)微生物細胞動物細胞大小1-10μm10-100μm代謝調(diào)節(jié)方式內(nèi)部內(nèi)部和激素營養(yǎng)要求寬松，可利用多種底物苛刻生長速率倍增時間一般為0.5-2h倍增時間一般為12-60h機械強度較好很差，缺乏保護性細胞壁環(huán)境適應好差當前48頁，共99頁，星期日。微生物細胞動物細胞PH控制添加酸、堿CO2-HCO3緩沖液攪拌速度速度快、范圍廣較慢溶氧控制改變攪拌速度、通氣量、進氣氧濃度改變進入氣體的氧濃度培養(yǎng)基滅菌方法高溫蒸煮過濾培養(yǎng)時間幾小時—幾天幾天—3、4周對水純度的要求較低很高當前49頁，共99頁，星期日。中空纖維式生物反應器占地空間小，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低；C127細胞：來自RⅢ小鼠腫瘤細胞，適用于攜帶有牛乳頭瘤病毒的載體的轉(zhuǎn)染。操作簡便、無化學毒性、對細胞損傷小、融合同步和融合率高，可在顯微鏡下直接觀察融合情況。8%的高倍體率，常用培養(yǎng)基為RPMI1640，需添加7%胎牛血清培養(yǎng)，外源蛋白表達水平很高。當前12頁，共99頁，星期日。不同的細胞對培養(yǎng)基的要求也會有所不同。②不能耐受高壓滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌；中空纖維式生物反應器（1）溫度，常用于檢測反應器溫度的是電阻溫度計。第九節(jié)動物細胞產(chǎn)品的制造實例當前4頁，共99頁，星期日。微載體細胞培養(yǎng)中使用。磷酸鈣沉淀法和電穿孔法。當前45頁，共99頁，星期日。Namalwa細胞：從肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的患者體內(nèi)獲取后構(gòu)建的一株人的類淋巴母細胞，該細胞是完全分化的B淋巴細胞，有2.二、動物細胞培養(yǎng)基的種類和組成

培養(yǎng)基成分復雜而且昂貴是動物細胞工程制藥成本較高的一個主要原因。動物細胞培養(yǎng)基主要分為三類：

天然培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基。當前50頁，共99頁，星期日。1、天然培養(yǎng)基

在細胞培養(yǎng)的早期階段使用的培養(yǎng)基，主要為來自天然的材料如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。

天然培養(yǎng)基材料成分復雜、組分不穩(wěn)定，來源有限，不適于大量培養(yǎng)和生產(chǎn)的需要。當前51頁，共99頁，星期日。2.合成培養(yǎng)基

采用明確的化學試劑配制成的培養(yǎng)基。第一個合成培養(yǎng)基：199培養(yǎng)基。

合成培養(yǎng)基成分明確、組分穩(wěn)定，可以大量生產(chǎn)。

現(xiàn)階段合成培養(yǎng)基種類繁多，在動物細胞培養(yǎng)中被普遍使用。當前52頁，共99頁，星期日。合成培養(yǎng)基組分：（1）氨基酸。

不同培養(yǎng)基中氨基酸的種類和含量各不相同，至少含有細胞在生長過程中所必需的而又不能依靠自身合成的12種必須氨基酸，另外多有谷氨酰胺作為細胞生長的碳源和能源物質(zhì)。動物細胞只能利用L型氨基酸，在配制時必須采用L型同分異構(gòu)體。（2） 維生素

用于維持細胞生命活動的低分子活性物質(zhì)，常作為輔酶或輔基。細胞自身基本不能合成維生素，必須從培養(yǎng)基中攝取。當前53頁，共99頁，星期日。（3）糖類，細胞生長的碳源和能源物質(zhì)。（4） 無機鹽保持細胞的滲透壓，緩沖pH的變化，并積極參與細胞的代謝（NaCl、KCl等），CuSO4、ZnSO4等可以促進細胞的代謝。（5）其他成分，在培養(yǎng)基中加入一些核酸的前體及氧化還原劑。當前54頁，共99頁，星期日。市售動物細胞合成培養(yǎng)基當前55頁，共99頁，星期日。

為了給細胞培養(yǎng)以更大的方便，以便于其增殖或貼附生長，常在培養(yǎng)基中加入一定量的動物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，雜交瘤細胞的培養(yǎng)中，對血清的要求更高，常用10~20%的胎牛血清。培養(yǎng)用血清當前56頁，共99頁，星期日。

添加血清培養(yǎng)動物細胞的作用：①為細胞生長提供有利其增殖的各種生長因子和激素。②提供有利于細胞貼壁所需要的貼附因子和伸展因子。③提供細胞識別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白。④提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素。⑤提供良好的pH緩沖系統(tǒng)。當前57頁，共99頁，星期日。3.無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點：

①提高了細胞培養(yǎng)的可重復性，避免了由于血清批之間差異的影響；

②減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；

③供應充足、穩(wěn)定；

④細胞產(chǎn)品容易純化；

⑤避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；

⑥減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實驗結(jié)果的分析。當前58頁，共99頁，星期日。

無血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入一些添加劑，添加的物質(zhì)主要有：①激素和生長因子；②結(jié)合蛋白；③貼附和伸展因子；④其他有利于細胞生長的因子和元素。德國PAN牌CHO細胞無血清培養(yǎng)液PANSERIN604S，培養(yǎng)基不含不明確的溶解產(chǎn)物和任何植物水解產(chǎn)物,不含任何蛋白質(zhì)。沒有任何動物、人類蛋白或多肽，為表達產(chǎn)品的下游處理工作提供極大方便。當前59頁，共99頁，星期日。第五節(jié)動物細胞培養(yǎng)的基本方法一、細胞培養(yǎng)的分類培養(yǎng)細胞的種類：原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)培養(yǎng)基的不同：液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)培養(yǎng)容器的方式：靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)當前60頁，共99頁，星期日。二、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1細胞分離①離心分離法：主要用于從含有細胞體液如血液、羊水、胸腹水中分離細胞，一般用800-1000r/min離心5~10min②消化分離：用消化液消化取自生物體的組織塊，使組織松散成細胞懸液，再經(jīng)洗滌、分離得到所需細胞。

常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA、或胰酶-EDTA聯(lián)用及胰酶-檸檬酸鹽。當前61頁，共99頁，星期日。2.

細胞計數(shù)：細胞分離制備成懸液準備接種時需進行細胞計數(shù)。細胞計數(shù)方法：①自動細胞計數(shù)器計數(shù)：電子細胞自動計數(shù)器，計數(shù)速度快，但無法分辨死、活細胞。全自動細胞計數(shù)分析儀當前62頁，共99頁，星期日。②血球計數(shù)板計數(shù)：計數(shù)時細胞染色，可分辨死、活細胞。

將細胞懸液進行適當?shù)南♂?，然后吸取少量的稀釋后懸液滴于計?shù)板上蓋玻片一端，讓液體填滿蓋玻片下方間隙，不要產(chǎn)生氣泡，稍靜置幾分鐘在顯微鏡下觀察并計算四角大格內(nèi)的細胞數(shù)，細胞壓線只計算壓上線和右線的，然后利用公式：

每毫升細胞數(shù)=4大格中細胞總數(shù)/（4×10000×稀釋倍數(shù)）

上面公式中分母乘以10000是因為四角每一個大格面積為1mm2，蓋玻片和計數(shù)板之間的間隙為0.1mm，所以每一個大格內(nèi)容積為0.1mm3，要計算1ml懸液的細胞數(shù)就要擴大10000倍。

可以通過染色的方法區(qū)別細胞的死活。常用的染色劑有：①臺盼藍，是一種細胞活性染料，常用于檢測細胞膜的完整性。還常用于檢測細胞是否存活。活細胞不會被染成藍色，而死細胞會被染成淡藍色。②苯胺黑，色較臺盼藍深，有毒。當前63頁，共99頁，星期日。血細胞計數(shù)板當前64頁，共99頁，星期日。③結(jié)晶紫染色細胞核計數(shù)

結(jié)晶紫染色液具有低滲作用，使細胞分散解離和破碎，將細胞核染成藍色，鏡下對細胞核計數(shù)。

微載體細胞培養(yǎng)中使用。④MTT染色計數(shù)

細胞內(nèi)線粒體脫氫酶將MTT（四甲基偶唑鹽，藍色）轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙Y(jié)晶（甲臜）。當前65頁，共99頁，星期日。3細胞傳代

細胞生長至一定時期時會產(chǎn)生接觸抑制現(xiàn)象，不能無限生長，若細胞不及時分種，細胞就會死亡、脫落。懸浮細胞的傳代：加入1倍或幾倍的生長液，然后分種兩只或多個培養(yǎng)瓶。貼壁細胞的傳代：需經(jīng)消化液消化后再分種。當前66頁，共99頁，星期日。（1）要確保需消化的細胞無污染；（2）加入消化液適量，以搖動時能蓋滿單層細胞為宜；（3）消化時間要適量，一般室溫2-5分鐘，細胞層出現(xiàn)網(wǎng)孔時即可停止；（4）終止消化要先去掉消化液，再加入含血清的培養(yǎng)基；（5）分種數(shù)取決于細胞數(shù)和細胞特性，一般20萬-30萬個/ml，每次1傳2或1傳3為宜；（6）已培養(yǎng)過的瓶子可再次使用，但不要超過2-3次；（7）傳代細胞培養(yǎng)時必須標明傳代次數(shù)；（8）傳代后1-2天更換培養(yǎng)液，3-5天傳代一次。貼壁細胞分種的主意事項：當前67頁，共99頁，星期日。4.細胞的凍存和復蘇（1）細胞的凍存

細胞的凍存常采用液氮低溫凍存，在凍存過程中需加入適量甘油或二甲基亞砜作為保護劑。

如采用冷凍方法凍存要注意冷凍速度的把握，溫度下降以1℃/min為宜。當前68頁，共99頁，星期日。細胞凍存過程中需注意：①凍存的細胞需處于良好的狀態(tài)；②細胞密度以1×106~2×106/ml為好；③配置凍存用的培養(yǎng)基要與實際使用的一致。④凍存管或瓶要注意密封；⑤凍存管標簽上標明細胞名稱、編號、凍存日期，最好在外面再貼一層透明膠布。（2）細胞的復蘇細胞復蘇總得要求是快融。當前69頁，共99頁，星期日。復蘇細胞、接種細胞、保存細胞當前70頁，共99頁，星期日。第六節(jié)動物細胞的大量培養(yǎng)的方法和操作一、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法1.懸浮培養(yǎng)

讓細胞自由的懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長增殖，適用于一切種類的非貼壁依賴性細胞，也適用于兼性貼壁細胞。

操作簡便，培養(yǎng)方法均一，傳質(zhì)和傳氧好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，培養(yǎng)出的細胞密度較低。當前71頁，共99頁，星期日。2.貼壁培養(yǎng)

讓細胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法，適用于一切貼壁依賴性細胞，也適用于兼性貼壁細胞。

這種培養(yǎng)方法的優(yōu)缺、點同懸浮培養(yǎng)正好相反。當前72頁，共99頁，星期日。3.貼壁-懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）

將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點結(jié)合在一起而成貼壁-懸浮培養(yǎng)。（1） 微載體培養(yǎng)，利用小顆粒載體使貼壁細胞附著其上培養(yǎng)增殖，而載體體積小、比重輕，在輕度攪拌下就可攜帶附著其上的細胞懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點，又能提高細胞密度。當前73頁，共99頁，星期日。理想的微載體要有如下特征：①載體表面性質(zhì)同細胞有良好的相容性，適于細胞的附著、伸展和增殖；②微載體材料無毒性；③微載體材料不與培養(yǎng)基成分發(fā)生化學變化，也不吸收培養(yǎng)基中養(yǎng)分；④微載體比重要適中；⑤微載體體積勻稱、均一，利于細胞均勻分布；⑥具有良好的光學透明性，易于鏡下觀察；⑦微載體基質(zhì)最好為軟性的；⑧可耐120℃高溫；⑨處理后可反復使用；⑩原料充分，制作簡便，價廉。當前74頁，共99頁，星期日。（2） 包埋和微囊培養(yǎng)，將細胞包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)培養(yǎng)，包埋的凝膠載體較大，此法又稱為巨載體培養(yǎng)。（3）結(jié)團培養(yǎng)，以細胞本身作為基質(zhì)，使其相互貼附后再用懸浮的方法進行培養(yǎng)。當前75頁，共99頁，星期日。二、動物細胞的培養(yǎng)的操作方式1.分批式培養(yǎng)操作兩種操作方法：

①將細胞和培養(yǎng)基一次性加入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，細胞不斷增長、產(chǎn)物不斷形成、積累，最后將細胞和培養(yǎng)基一并取出，結(jié)束培養(yǎng)；

②先將細胞和培養(yǎng)基加入反應器，待細胞生長至一定密度后，在反應器中加入誘導劑或病毒等，作用一段時間后，將反應物取出。當前76頁，共99頁，星期日。2.半連續(xù)性培養(yǎng)操作

當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物的形成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養(yǎng)物（條件培養(yǎng)基或附著在載體上），然后補充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基或載體，繼續(xù)培養(yǎng)。當前77頁，共99頁，星期日。3.灌流式培養(yǎng)操作

當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將一部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補充新鮮培養(yǎng)基。優(yōu)點：（1）培養(yǎng)條件穩(wěn)定、營養(yǎng)條件好、有害代謝廢物濃度低；（2）極大的提高細胞密度；（3）產(chǎn)品在培養(yǎng)罐內(nèi)時間縮短，可及時低溫保存，提高產(chǎn)品質(zhì)量；（4）培養(yǎng)基比消耗率降低，降低成本。當前78頁，共99頁，星期日。第七節(jié)動物細胞生物反應器

動物細胞生物反應器是給動物細胞的生長代謝提供一個最優(yōu)化的環(huán)境，從而使其在生長代謝過程中產(chǎn)生出最大量、最優(yōu)質(zhì)的所需物質(zhì)。理想的動物細胞生物反應器應該具有如下特征：（1）制造生物反應器所需要的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基、細胞直接接觸的材料，對細胞必須是無毒性的；（2）生物反應器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能；當前79頁，共99頁，星期日。（3）密封性能良好，可避免一切外來的不需要的微生物的污染；（4）對培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學參數(shù)能自動檢測和調(diào)解控制，控制的精確度高，而且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一；（5）可長期連續(xù)運轉(zhuǎn)，這對于培養(yǎng)動物細胞的生物反應器顯得尤為重要（6）容器加工制造時要求內(nèi)面光滑，無死角，以減少細胞或微生物的沉積；（7）拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修；（8）設(shè)備成本盡可能低。

實驗室規(guī)模——20L

中試規(guī)?！?0-100L

生產(chǎn)規(guī)?！?00L。當前80頁，共99頁，星期日。一、動物細胞生物反應器的類型及基本結(jié)構(gòu)生產(chǎn)中常用的細胞生物反應器有：

攪拌罐式生物反應器

氣升式生物反應器

中空纖維式生物反應器

透析袋或膜式生物反應器

固定床或流化床式生物反應器等。當前81頁，共99頁，星期日。1.攪拌罐式生物反應器

攪拌罐式生物反應器是通過借鑒細菌發(fā)酵罐得到的動物細胞反應器，是目前大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的主要生產(chǎn)設(shè)備。

（1）罐體的高徑比一般采用1~1.5：1，利于增大與空氣的接觸面；培養(yǎng)動物細胞的罐底為圓形，以避免細胞和載體沉積在周邊；

（2）為防止攪拌產(chǎn)生的切力損傷細胞，攪拌速度慢，一般在20~100r/min，故多數(shù)傾向于采用較大的傾斜式槳葉攪拌器或船舶推進式槳葉攪拌器；

（3）一般采用無氣泡通氣系統(tǒng)，以解決由于氣泡破裂時產(chǎn)生的作用力力對細胞的損傷；

（4）從高密度、長時間培養(yǎng)以及提高反應器的生產(chǎn)效率考慮，反應器需要配備有進出液體系統(tǒng)，以便進行灌流培養(yǎng)，并有使細胞與培養(yǎng)基分離使細胞保留在反應器內(nèi)的裝置。特點：當前82頁，共99頁，星期日。2.氣升式生物反應器

利用氣體通過裝在罐底的噴管進入反應器的導流管，致使該部液體的密度小于導流管外部的液體密度，而使液體形成循環(huán)流，循環(huán)方式有內(nèi)循環(huán)式和外循環(huán)式。當前83頁，共99頁，星期日。

溶氧:通過自動調(diào)節(jié)進入空氣的速率來控制；pH值：可通過在進氣中加入二氧化碳或加入氫氧化鈉來控制。

同攪拌式生物反應器相比，氣升式生物反應器具有剪切力小，混合均一，氧和營養(yǎng)的傳遞好，而且由于沒有了機械攪拌的結(jié)構(gòu)，有利于設(shè)備的密封，降低了造價，其高徑比一般在10：1左右。當前84頁，共99頁，星期日。3.中空纖維式生物反應器

途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長的細胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，細胞的密度最高可達109/ml數(shù)量級。如果控制系統(tǒng)不受污染，能長期運轉(zhuǎn)。中空纖維反應器示意圖細胞培養(yǎng)基入口培養(yǎng)基出口空氣與CO2出口空氣與CO2入口

中空纖維式生物反應器占地空間小，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低；其不足之處在于：①不能重復使用；②不能耐受高壓滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌；③難以取樣檢測當前85頁，共99頁，星期日。4.透析袋或膜式生物反應器

在動物細胞培養(yǎng)過程中，會產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如乳酸和氨等，對細胞的生長和產(chǎn)物的產(chǎn)生會產(chǎn)生抑制作用，透析袋或膜式反應器可將這些有害代謝產(chǎn)物透析或過濾掉，從而使細胞生長至更高密度，同時可根據(jù)需要選用不同相對分子質(zhì)量的膜，使產(chǎn)物保留在膜內(nèi)或與細胞分離開。當前86頁，共99頁，星期日。5.固定床或流化床式生物反應器固定床結(jié)構(gòu)簡單、裝填的材料多樣且相對固定，只要是對細胞無毒又有利于細胞貼附的材料（不銹鋼、玻璃杯、玻璃珠、光面陶瓷、塑料等實心載體或有孔的陶瓷、玻璃和聚氨基塑料等）皆可利用。

固定床生物反應器通常填裝材料體積較大，導致反應器內(nèi)細胞因營養(yǎng)物質(zhì)和氧的交換不夠充分而影響生長和代謝，所以漸減小填充載體，演化為流化床生物反應器。當前87頁，共99頁，星期日。氣體交換氧氣回流收獲營養(yǎng)液泵反應塔加熱器PH傳感器TDOCO2生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應器示意圖①傳質(zhì)性能很好，并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細胞所需的氧，同時排除代謝產(chǎn)物；

②反應器中的液體流速足以使細胞微粒懸浮卻不會損壞脆弱的細胞，既可用于貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)，又可用于非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。③可實現(xiàn)高密度細胞培養(yǎng)、使高產(chǎn)量細胞長時間停留在反應器中、優(yōu)化細胞生長與產(chǎn)物合成的環(huán)境等細胞培養(yǎng)的要求。當前88頁，共99頁，星期日。二、動物細胞生物反應器的檢測控制系統(tǒng)1、培養(yǎng)過程中需檢測的物化參數(shù)

細胞培養(yǎng)可選擇不同的反應器，但培養(yǎng)過程中需檢測的參數(shù)大致相同。

在線檢測的參數(shù)：溫度、pH、攪拌速度、溶氧等；

取樣離線檢測的參數(shù)：如活細胞數(shù)、氨基酸濃度分析、葡萄糖、乳酸和銨離子的檢測等；

檢測后計算獲得的參數(shù)：如細胞的群體倍增時間、細胞的比增長率、葡萄糖消耗率、乳酸產(chǎn)率、生物反應器生產(chǎn)率等。當前89頁，共99頁，星期日。2.主要參數(shù)的檢測和控制方法

在動物細胞培養(yǎng)中，溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速和進出液流量等幾個參數(shù)最為重要。（1）溫度，常用于檢測反應器溫度的是電阻溫度計。（2）pH，復合式參比電極。（3）溶氧，極譜式或電流式覆膜電極