四氯化碳藥物性肝損傷體外模型的改進(jìn)

四氯化碳藥物性肝損傷體外模型的改進(jìn)目的：建立一個較理想的CC14藥物性肝損傷體外模型。方法：分別采用傳統(tǒng)方法和改進(jìn)方法配制CC14損傷液并誘導(dǎo)人肝HepG2細(xì)胞損傷，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，生化法檢測上清液中ALT水平并采用MTT法測定細(xì)胞活性。結(jié)果：改進(jìn)方法的CC14誘導(dǎo)損傷效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法，隨著CC14損傷液濃度的提高，上清液中ALT水平明顯升高，而細(xì)胞活性顯著降低，70%濃度CC14損傷液誘導(dǎo)損傷4h可獲得最佳損傷效果。結(jié)論：利用改進(jìn)方法可在體外實驗中建立較理想的CC14藥物性肝損傷模型，此模型可為進(jìn)一步的體外實驗研究奠定基礎(chǔ)。標(biāo)簽：四氯化碳；HepG2細(xì)胞；藥物性肝損傷中醫(yī)藥理論博大精深，許多中草藥都有一定的保肝作用，在藥物保肝活性的基礎(chǔ)研究中，常需要建立較穩(wěn)定的肝損傷模型。四氯化碳（carbontetrachloride，CCl4）肝損傷模型是研究藥物保肝活性的常用模型之一，其引起肝損傷的病理基礎(chǔ)主要是脂質(zhì)過氧化及自由基的產(chǎn)生［1-2］。通過腹腔注射CCl4建立的小鼠急性肝損傷動物模型已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但在體外實驗中，CCl4建立的肝損傷體外模型一直不太理想，傳統(tǒng)的CCl4肝損傷體外模型常采用結(jié)晶細(xì)小的CCl4懸液損傷細(xì)胞，不少學(xué)者在研究中藥及其他藥物保肝活性時都采用這種方法建立肝損傷體外模型［3-7］。但此法在實際操作中可控性差，損傷效果不穩(wěn)定，損傷也不均勻，對后續(xù)藥物保肝活性的研究結(jié)果影響較大。因此，建立一個較理想的CCl4肝損傷體外模型，以克服傳統(tǒng)CCl4體外模型中的缺點和不足，對于進(jìn)一步研究藥物保肝活性是很有必要的。材料和方法藥品與試劑HepG2細(xì)胞株（由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所提供）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號090704）；DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司，批號SH30022.01B）；ALT試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20100209）；MTT（珠海麗寶生物化學(xué)制藥有限公司，批號BY11086）；二甲基亞砜（廣州新港化工有限公司，批號20080616）；四氯化碳（山東萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠，批號20020110）。儀器HF-151UV型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；XD-101型倒置相差顯微鏡（德國Zeiss）；MultiskanMK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo）。CCl4損傷液的制備傳統(tǒng)方法［3-7］：將二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）與CCl4以適當(dāng)比例混合，充分震蕩后加入DMEM培養(yǎng)液中（本實驗終濃度為0.4mol?L-1），得到結(jié)晶細(xì)小的CCl4懸液。用前震蕩后使用。改進(jìn)方法：向DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中加入過量CCl4,于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24h，此時CCl4結(jié)晶沉集在瓶底，而CCl4結(jié)晶上方即為37℃時的飽和CCl4損傷液，將上層飽和CCl4損傷液吸取出來保存于37℃環(huán)境中備用（吸取時注意別吸到下方的CCl4結(jié)晶）。使用時，將飽和損傷液與正常DMEM培養(yǎng)液分別按5：5，7：3，10：0的比例充分混勻，配制成50%，70%，100%的CCl4損傷液。損傷時先吸棄各培養(yǎng)孔中的原培養(yǎng)液，然后換入等體積相應(yīng)濃度的CCl4損傷液。細(xì)胞培養(yǎng)及分組HepG2細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上，取對數(shù)生長期增殖活躍的細(xì)胞進(jìn)行分組損傷試驗，正常對照組換入正常培養(yǎng)液；傳統(tǒng)損傷組加入傳統(tǒng)方法制備的CC14損傷液；50%,70%,100%改進(jìn)方法損傷組分別換入等體積的50%,70%,100%濃度CC14損傷液。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將對數(shù)生長期細(xì)胞以3x104個/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL。設(shè)正常對照組，傳統(tǒng)方法損傷組和50%，70%，100%改進(jìn)方法損傷組。倒置相差顯微鏡活體觀察細(xì)胞生長情況，并在CC14損傷后0.5，2,4h拍照記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。上清液中轉(zhuǎn)氨酶檢測HepG2細(xì)胞以3x104個/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板,設(shè)正常對照組和50%,70%和100%改進(jìn)方法損傷組,每組6個復(fù)孔,每孔1mL。于損傷后4h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒操作步驟處理，使用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT吸光度A,查找標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相應(yīng)酶活力值。MTT法測定細(xì)胞活力HepG2細(xì)胞以5x104個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板,設(shè)正常對照組和50%,70%,100%改進(jìn)方法損傷組,每組6個復(fù)孔,每孔100rL。CC14損傷4h時各組同時加入20rLMTT（5g?L-1）,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后取出培養(yǎng)板，吸凈培養(yǎng)液后每孔加入100rLDMSO,待顆粒全部溶解后，用酶標(biāo)儀測定吸光度A570nm,細(xì)胞相對存活率=（A實驗組-A空白組）/（A正常對照組-A空白組）x100%。2結(jié)果傳統(tǒng)方法組和改進(jìn)方法組形態(tài)學(xué)比較正常HepG2細(xì)胞形態(tài)呈梭形或多邊形，胞體清晰飽滿，立體感強(qiáng)，核圓形或不規(guī)則。CC14損傷后4h,傳統(tǒng)方法組培養(yǎng)液中可見大小不等的CC14顆粒（圖1中箭頭所指處），顆粒周圍細(xì)胞損傷嚴(yán)重，壞死細(xì)胞多見，而遠(yuǎn)離CC14顆粒的細(xì)胞生長良好，形態(tài)無明顯變化，未見明顯回縮變形的細(xì)胞。改良方法組（70%濃度）培養(yǎng)液中無CC14顆粒，形態(tài)發(fā)生改變的細(xì)胞均勻地分布在整個視野中,部分細(xì)胞周圍出現(xiàn)凋亡小體,見圖1。改進(jìn)方法組中不同濃度組形態(tài)學(xué)觀察（損傷后4h）CC14損傷后4h,改良方法組中50%損傷組僅有少量明顯回縮變形的細(xì)胞,大部分細(xì)胞形態(tài)飽滿,立體感仍較強(qiáng)。70%損傷組變形細(xì)胞多見,細(xì)胞立體感較差,但尚可見到一定比例的正常細(xì)胞,部分細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞特征：染色質(zhì)固縮、邊集呈新月形或帽狀,細(xì)胞表面形成多個大小不一的球狀凋亡小體,部分凋亡小體從細(xì)胞上脫落。100%損傷組細(xì)胞毫無立體感,多數(shù)細(xì)胞直接壞死,見圖2。改進(jìn)方法組中70%損傷組不同損傷時間形態(tài)學(xué)觀察改進(jìn)方法組中70%損傷組損傷后0.5h,多數(shù)細(xì)胞形態(tài)基本正常，胞體飽滿，立體感依然較強(qiáng)，未見典型凋亡細(xì)胞。損傷后2h部分細(xì)胞明顯回縮變形，細(xì)胞立體感變差。損傷后4h回縮變形的細(xì)胞明顯增多，立體感差，出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞，部分細(xì)胞周圍可見許多向外突起的凋亡小體,見圖3。上清液中轉(zhuǎn)氨酶檢測CC14誘導(dǎo)損傷后4h,正常組和50%,70%,100%損傷組上清液ALT水平分別為（34.40±4.23）,（57.14±5.06）,（94.10±4.11）,（108.18±6.03）UL-1,隨著損傷濃度的提高，HepG2細(xì)胞釋放的ALT顯著增加，任意2組間具有顯著差異（P<0.05）,其中70%損傷組釋放的ALT增加到正常細(xì)胞的近3倍,造成肝細(xì)胞中度損傷。MTT法測定細(xì)胞活性CC14誘導(dǎo)損傷后4h,MTT法檢測正常組和50%,70%,100%損傷組HepG2細(xì)胞活性，分別為（100±2.51）%,（66.13±5.09）%,（34.17±4.07）%,（16.16±3.26）%,CC14誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生不同程度的損傷，細(xì)胞活性隨損傷濃度的增加而逐漸降低，且任意2組間具有顯著差異（P<0.05）。3討論在多種肝病的肝細(xì)胞損傷中氧化應(yīng)激是一個重要的損傷機(jī)制，CC14進(jìn)入機(jī)體后在肝臟經(jīng)細(xì)胞色素P450激活，生成的自由基破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，細(xì)胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的可溶性酶滲出，自由基還可抑制細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣泵的活性，使胞漿內(nèi)CaZ+水平升高，堆積于細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死［8-9］。因此，CC14被廣泛用來制作藥物性肝損傷實驗?zāi)Ｐ汀鹘y(tǒng)的CC14藥物性肝損傷體外模型［3-7］常采用結(jié)晶細(xì)小的CC14懸液損傷細(xì)胞，作者在藥物保肝活性的實驗中發(fā)現(xiàn)這種損傷方法在實際操作中有不少缺點：由于CC14幾乎不溶于水，即使采用助溶劑如DMSO,CC14也不能均勻地分散在培養(yǎng)液中，而是以大小不等的CC14顆粒的形式存在于培養(yǎng)液中，單個細(xì)胞所處微環(huán)境相差很大，靠近CC14顆粒的細(xì)胞損傷嚴(yán)重，遠(yuǎn)離CC14顆粒的細(xì)胞卻損傷輕微甚至未受損傷，導(dǎo)致同一培養(yǎng)孔中損傷極不均勻，同一實驗組各培養(yǎng)孔的損傷情況也相差很大；實驗中需要改變CC14的濃度以調(diào)整損傷效果時，實際上很多時候只是改變了培養(yǎng)孔中CC14顆粒的數(shù)量，而沒有改變單個細(xì)胞的損傷微環(huán)境；配制CC14損傷液需長時間反復(fù)震蕩，即使這樣也無法保證同一組各培養(yǎng)孔中的CC14晶體量相等，不能保證各培養(yǎng)孔中CC14的濃度相等，采用傳統(tǒng)方法時CC14的真正損傷濃度受到質(zhì)疑?？傊?，此法操作復(fù)雜，損傷效果不穩(wěn)定，可控性差，損傷極不均勻，即使同一損傷組細(xì)胞的損傷效果也大相徑庭，影響后續(xù)的實驗結(jié)果。而改良方法可有效克服以上缺點，CC14均勻地分布在培養(yǎng)液中，同一孔中各處損傷均勻，同一組各培養(yǎng)孔損傷效果也基本一致。實驗中改變CC14的濃度以調(diào)整損傷效果時，單個細(xì)胞的損傷微環(huán)境也可隨之變化。改良方法雖然沒能準(zhǔn)確得知CC14損傷濃度值，但在37℃下，CC14飽和損傷液的濃度是恒定的，且因為細(xì)胞是在37℃培養(yǎng)，不管損傷濃度如何（必定勺00%），可以保證損傷液中始終無CC14析出。改良方法損傷均勻，可控性好，損傷效果也比較穩(wěn)定，且操作簡單，可重復(fù)性好。綜合形態(tài)學(xué)定性觀察和上清液ALT及MTT細(xì)胞活性定量檢測結(jié)果，采用改良方法組中70%濃度CC14損傷液損傷4h可建立較理想的體外HepG2肝細(xì)胞損傷模型。在實驗中作者還發(fā)現(xiàn)不同類型的細(xì)胞、不同的細(xì)胞接種密度損傷效果會有差異。比如，在同樣細(xì)胞密度下，L-02細(xì)胞所需的損傷濃度常低于HepG2細(xì)胞，前者用60%濃度CC14就可達(dá)到后者70%濃度CC14才能達(dá)到的損傷效果。而對于同一種細(xì)胞，細(xì)胞接種密度越大，所需損傷濃度也將越高，損傷時間也越長。鑒于改良損傷模型具有以上特點，作者建議使用該損傷方法時注意以下事宜：進(jìn)行具體實驗時，最好先以較小的區(qū)間設(shè)置損傷濃度梯度，摸索出最適損傷濃度和損傷時間；將過量的CC14加入培養(yǎng)液中提前配制飽和損傷液，并置于37℃環(huán)境，使CC14有充分的時間達(dá)到飽和，但時間不宜過長，以免培養(yǎng)液變性；用容器充分混勻所需損傷濃度損傷液后再加損傷，盡量別在有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)孔中混合損傷液，以免混合不均勻，加損傷液方法與換液方法相同，即先吸棄培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)孔中原培養(yǎng)液，再換入等體積合適濃度的損傷液；操作過程中，不宜長時間將損傷液置于低溫環(huán)境，以免CC14析出。總之，利用最適損傷濃度的CC14損傷液與肝細(xì)胞共培養(yǎng)最適損傷時間，可建立較理想的藥物性肝損傷體外模型。需特別注意的是，對于不同的培養(yǎng)液類型、細(xì)胞株、細(xì)胞接種密度以及不同的實驗需要，這個最適濃度和最適時間是不同的，考慮到要為保肝藥物作用的發(fā)揮提供一個適當(dāng)?shù)目臻g和時間，實驗者在建立相應(yīng)體外模型時還需根據(jù)自己的實際情況進(jìn)行摸索和選擇。[參考文獻(xiàn)]LeeBJ，SenevirathneM，KimJS，etal.Protectiveeffectoffermentedseatangleagainstethanolandcarbontetrachloride-inducedhepaticdamageinSprague-Dawleyrats[J].FoodChemToxicol，2010，48（4）：1123.ZhuRZ，XiangD，XieC，etal.ProtectiveeffectofrecombinanthumanIL-1RaonCCl4-inducedacuteliverinjuryinmice[J].WorldJGastroenterol，2010，16（22）：2771.[3]劉功讓，管培中，宋淑亮，等.絞股藍(lán)多糖對四氯化碳損傷HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用[J].山東醫(yī)藥，2007，47（31）：27.焦楊，段小群，林興，等.玉郎傘多糖對四氯化碳誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26（11）：1333.肖永紅，劉殿武.復(fù)方中藥血清對四氯化碳刺激的肝星狀細(xì)胞NO和ET-1的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，27（18）：1655.范適，左家哺，易誠，等.新生大鼠原代肝細(xì)胞四氯化碳損傷模型與葉下珠保肝活性成分的提取與初步分離[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007,11（38）：7581.梁莉，王婷，喬華，等.南沙參多糖對四氯化碳損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞保護(hù)作用的研究[/.中國藥房，2007，18（24）：1853.KimHY， 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Shanghai200040，China；InterventionalRadiology，Beijing301Hospital，Beijing100853，China）[Abstract]Objective：ToestablishanidealCCl4drug-inducedliverinjurymodelinvitro.Method：TraditionalmethodandimprovedmethodwereadoptedforpreparingCCl4injuryliquidanddrug-inducedhumanliverHepG2cellinjury.Cellmorphologicalchangewasobservedunderabright-fieldmicroscope.Thelevelofalanineaminotransferase（ALT）insupernatantwasdetectedbybiochemicalmethod.4-Methyl-tetrazolium（MTT）chromatometrywasadoptedfordeterminingcellactivity.Result：TheimprovedmethodshowedbetterCCl4-inducedinjuryeffectthanthetraditionalmethod.WiththeincreaseintheconcentrationofCCl4injuryliquid，theALTlevelsignificant