化學(xué)品 體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法 征求意見(jiàn)稿

1GB/T21769—XXXX化學(xué)品體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了化學(xué)品體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)的范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)定義和縮略語(yǔ)、試驗(yàn)基本原則、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)結(jié)果和試驗(yàn)報(bào)告。本文件適用于化學(xué)品潛在光毒性的篩選和檢測(cè)。本文件可作為化學(xué)品光毒性動(dòng)物試驗(yàn)的替代方法之一。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)下列術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)適用于本文件。3.1術(shù)語(yǔ)和定義3.1.1輻照度irradiance入射到某一表面的紫外線（UV）或可見(jiàn)光（Vis）的強(qiáng)度，單位為W/m2或mW/cm2。3.1.2光劑量doseoflight入射到某一表面的紫外線或可見(jiàn)光的量（強(qiáng)度×?xí)r間以單位表面積的焦耳數(shù)表示，即J/m2或J/cm2。3.1.3紫外線波長(zhǎng)UVlightwavebands國(guó)際照明委員會(huì)（CIE，CommissionInternationaledeL’Eclairage）推薦的定義為：UVA（315nm~400nm）、UVB（280nm～315nm）和UVC(100nm～280nm)。其他一些定義也可采用；UVB和UVA的分界線通常在320nm，UVA可在340nm處分為UV-A1和UV-A2。3.1.4細(xì)胞活性cellviability測(cè)量某一細(xì)胞群總活性的參數(shù)（如細(xì)胞溶酶體攝取活性染料中性紅其數(shù)值取決于測(cè)定的終點(diǎn)和試驗(yàn)所用的設(shè)計(jì)方案，并與細(xì)胞總數(shù)和/或細(xì)胞活力相關(guān)。23.1.5相對(duì)細(xì)胞活性relativecellviability通過(guò)與溶劑（陰性）對(duì)照組的相關(guān)性來(lái)表達(dá)的細(xì)胞活性，對(duì)照組除了未經(jīng)受試化學(xué)物質(zhì)處理外，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程與試驗(yàn)組一樣（或+Irr或-Irr）。3.1.6光刺激因子photoirritationfactor，PIF在無(wú)細(xì)胞毒性的紫外光/可見(jiàn)光（UV/vis）照射下，受試物分別在無(wú)光照（-Irr）和有光照（+Irr）條件下獲得兩組平行有效的細(xì)胞毒性濃度（IC50通過(guò)比較IC50的值得到的因子。3.1.7半數(shù)抑制濃度IC50使細(xì)胞活性下降50%的受試化學(xué)物質(zhì)的濃度。3.1.8平均光效應(yīng)meanphotoeffect，MPE在無(wú)細(xì)胞毒性的紫外光/可見(jiàn)光（UV/vis）照射下，受試物分別在無(wú)光照（-Irr）和有光照（+Irr）條件下獲得兩組濃度反應(yīng)曲線，通過(guò)數(shù)學(xué)分析導(dǎo)出的數(shù)值。3.1.9光毒性phototoxicity皮膚第一次接觸某種化學(xué)物質(zhì)繼而暴露于光下所引發(fā)的一種急性毒性反應(yīng)；或者全身應(yīng)用一種化學(xué)物質(zhì)后，暴露于光下所發(fā)生的類似皮膚照射的反應(yīng)。3.1.10混合物mixture由兩種或兩種以上不發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)組成的混合物或溶液。3.1.11摩爾消光/吸收系數(shù)molarextinction/absorptioncoefficient，MEC任何給定分子在一組特定條件（例如溶劑、溫度和波長(zhǎng)）下的常數(shù)，反映分子吸收光子的效率，單位為L(zhǎng)/(mol·cm)。3.2縮略語(yǔ)CPZ：氯丙嗪（Chlorpromazine）NRU：中性紅攝?。∟eutralRedUptake）3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazinehydrochloride，CASNO.553-24-2；C.I.50040）OECD：經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopmen）3GB/T21769—XXXX4試驗(yàn)原理4.1光毒性是指局部或全身應(yīng)用光反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)且身體暴露在環(huán)境光下引發(fā)的毒性反應(yīng)。體外3T3中性紅攝?。∟eutralRedUptake，NRU）光毒性試驗(yàn)可以用于鑒別被光激活的測(cè)試化學(xué)物質(zhì)的潛在光毒性。本試驗(yàn)通過(guò)比較暴露于化學(xué)物質(zhì)的細(xì)胞在有和無(wú)光照條件下細(xì)胞活性相對(duì)降低的值來(lái)評(píng)價(jià)光細(xì)胞毒性，在該測(cè)試中被確定為陽(yáng)性的化學(xué)物質(zhì)局部或全身應(yīng)用并分布到皮膚和/或眼睛后可能在體內(nèi)具有光毒性。4.2本試驗(yàn)方法建立的基礎(chǔ)是比較有或無(wú)非細(xì)胞毒性劑量的模擬太陽(yáng)光照射情況下的細(xì)胞毒性。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞毒性是以受試物和光照射處理18h～24h后，與受試物濃度相關(guān)的攝取活性染料中性紅（NeutralRed,NR）還原量來(lái)表示的。中性紅是一種弱的陽(yáng)離子染料，極易以非離子擴(kuò)散的方式穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞溶酶體內(nèi)聚集。NR在pH接近中性的細(xì)胞質(zhì)中不帶電，但當(dāng)其處于低pH的溶酶體腔內(nèi)時(shí)會(huì)變成正電荷。維持溶酶體腔的低pH值，需要ATP，并且依賴于溶酶體膜的完整性。光毒性物質(zhì)可以通過(guò)形成活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）和其他機(jī)制，導(dǎo)致溶酶體膜的通透性增加，pH梯度降低，以及其他逐漸成為不可逆的變化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。這種由外來(lái)物質(zhì)的作用引起的變化，導(dǎo)致細(xì)胞吸收和連接NR的能力下降。這樣就有可能區(qū)分活的、損傷的或死亡的細(xì)胞。4.3BALB/c3T3細(xì)胞（見(jiàn)5.2.1）經(jīng)18h～24h培養(yǎng)形成單層細(xì)胞。每種受試物用兩塊96孔培養(yǎng)板，將8個(gè)不同濃度的受試化學(xué)物質(zhì)預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)。接著將其中一塊培養(yǎng)板暴露于照射劑量下，另一塊培養(yǎng)板置于暗處。然后在兩塊培養(yǎng)板中，用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基代替處理緩沖液再培養(yǎng)18h～24h后用中性紅攝取法測(cè)定細(xì)胞活性。以經(jīng)測(cè)試化學(xué)物質(zhì)處理的中性紅攝取值與溶劑對(duì)照的值相比的百分比表示細(xì)胞活性，分別計(jì)算每一測(cè)試濃度的值。通過(guò)比較有光照和無(wú)光照條件下獲得的濃度反應(yīng)來(lái)預(yù)測(cè)潛在光毒性，包括與未處理對(duì)照相比細(xì)胞活性降至50%的濃度（即IC50）。5試驗(yàn)方法5.1試驗(yàn)前須知5.1.1光化學(xué)特性許多種類的化學(xué)物質(zhì)能誘導(dǎo)產(chǎn)生光毒性效應(yīng)，它們的共同特點(diǎn)是在光的波長(zhǎng)范圍內(nèi)能夠吸收光能量。只有吸收足夠的光量子才能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。因此，在考慮進(jìn)行測(cè)試前，應(yīng)按OECD試驗(yàn)指南101的方法先測(cè)定受試化學(xué)物質(zhì)的紫外光/可見(jiàn)光吸收光譜。如果在甲醇中測(cè)試，化學(xué)物質(zhì)的摩爾消光/吸收系數(shù)（MEC）小于1000L/(mol·cm)，則該化學(xué)物質(zhì)不可能具有光反應(yīng)性。該化學(xué)物質(zhì)無(wú)須進(jìn)行體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)，或其他任何測(cè)定不良光化學(xué)效應(yīng)的生物學(xué)試驗(yàn)。一般而言，該原則適用于所有測(cè)試化學(xué)物質(zhì)，但根據(jù)化學(xué)物質(zhì)的預(yù)期用途或可能的暴露條件，可能更適用于特定的指南（例如藥品可按ICHS10測(cè)試）。見(jiàn)附錄A。5.1.2預(yù)測(cè)范圍對(duì)體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)的可靠性和相關(guān)性的評(píng)價(jià)結(jié)果表明，體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)?zāi)茴A(yù)測(cè)動(dòng)物和人的體內(nèi)急性光毒性效應(yīng)。本試驗(yàn)不能用于預(yù)測(cè)由于化學(xué)物質(zhì)與光聯(lián)合作用可能產(chǎn)生的其他不良效應(yīng)，例如光遺傳毒性、光過(guò)敏性或光致癌性。此外，本試驗(yàn)也不能闡明光毒性的間接機(jī)制，受試化學(xué)物質(zhì)的代謝作用或混合物效應(yīng)。然而，在某些情況下，體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)陰性結(jié)果表明該化學(xué)物質(zhì)可能無(wú)需進(jìn)行其他試驗(yàn)，如光遺傳毒性試驗(yàn)。45.1.3代謝活化系統(tǒng)體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)不需要通過(guò)代謝活化系統(tǒng)進(jìn)行，因?yàn)槟壳皼](méi)有證據(jù)表明在沒(méi)有代謝活化毒物的情況下會(huì)遺漏任何光毒性物質(zhì)。5.2試驗(yàn)準(zhǔn)備5.2.1細(xì)胞選用永生化小鼠成纖維細(xì)胞系BALB/c3T3，建議細(xì)胞株來(lái)源于具有公信力的機(jī)構(gòu)且能確保細(xì)胞品質(zhì)穩(wěn)定，如美國(guó)典型物質(zhì)保藏中心（ATCC）、歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心（ECACC）或其他具有公信力的機(jī)構(gòu)。根據(jù)OECD第34號(hào)指導(dǎo)文件的原則，如果培養(yǎng)條件能滿足細(xì)胞的特殊需要，其他細(xì)胞或細(xì)胞系也可用于本試驗(yàn)，但必須證明其等同性（即對(duì)參考化學(xué)物質(zhì)有適當(dāng)反應(yīng)）。細(xì)胞到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)檢查支原體污染，只有無(wú)支原體污染時(shí)才能使用。按本文件所規(guī)定的質(zhì)量控制步驟定期檢查BALB/c3T3細(xì)胞的紫外光敏感性非常重要。由于細(xì)胞對(duì)UVA的敏感性隨傳代數(shù)的增多可能增高，因此，應(yīng)使用可獲得的最低傳代數(shù)的BALB/c3T3細(xì)胞，傳代次數(shù)最好少于100次，見(jiàn)附錄B。如果使用更高代數(shù)的細(xì)胞，則必須提供數(shù)據(jù)來(lái)證明細(xì)胞符合本文件的質(zhì)量參數(shù)。5.2.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件常規(guī)細(xì)胞傳代和試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)使用合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。即對(duì)于BALB/c3T3細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium）補(bǔ)充10%新生小牛血清、4mM谷氨酰胺、青霉素（100IU）和鏈霉素（100μg/mL），在37℃,5%～7.5%CO2（視緩沖液不同而定，見(jiàn)），濕潤(rùn)條件下培養(yǎng)。根據(jù)使用的緩沖液，可以調(diào)整CO2水平。尤其重要的是細(xì)胞培養(yǎng)條件應(yīng)確保細(xì)胞或細(xì)胞系的細(xì)胞周期分裂時(shí)間在正常歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)。5.2.3培養(yǎng)物制備凍存細(xì)胞以一個(gè)合適的密度接種到培養(yǎng)基，并在用于光毒性試驗(yàn)前至少傳代一次。用于試驗(yàn)的細(xì)胞應(yīng)以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到培養(yǎng)基中。細(xì)胞接種密度應(yīng)保證在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，也即在接種48h后測(cè)定細(xì)胞活性時(shí)，仍未達(dá)到完全融合。對(duì)生長(zhǎng)在96孔培養(yǎng)板中的BALB/c3T3細(xì)胞，建議細(xì)胞接種密度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔。對(duì)每種受試化學(xué)物質(zhì)，細(xì)胞同時(shí)接種在兩個(gè)96孔培養(yǎng)板上，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中按相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，區(qū)別在于一塊培養(yǎng)板被照射（+Irr而另一塊培養(yǎng)板置于暗處（-Irr）。5.2.4受試化學(xué)物質(zhì)制備除非有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)證明儲(chǔ)存液可以使用，否則受試物必須在使用當(dāng)天新鮮配制并直接使用。建議所有的化學(xué)物質(zhì)操作和細(xì)胞處理初期都應(yīng)避免將受試物暴露于具有光活化或光降解的光線條件下。受試物應(yīng)溶解在緩沖鹽溶液中，例如Earle’s平衡鹽溶液（Hanks’BalancedSaltSolution，EBSS）、Hanks’平衡鹽溶液（Hanks’BalancedSaltSolution，HBSS）或其他生理平衡鹽溶液，平衡鹽溶液不應(yīng)含有蛋白質(zhì)成分和光吸收成份（如酚紅等pH指示劑和維生素以避免照射時(shí)產(chǎn)生干擾。因?yàn)檎丈淦陂g，細(xì)胞要在CO2培養(yǎng)箱外放置約50min，應(yīng)小心避免培養(yǎng)基堿化。如果細(xì)胞只在5%的CO2條件下培養(yǎng)，則應(yīng)選用更強(qiáng)緩沖作用的緩沖鹽溶液。在水中溶解度有限的受試化學(xué)物應(yīng)先將其溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?。溶劑的體積應(yīng)當(dāng)在所有培養(yǎng)物5GB/T21769—XXXX中保持一致，即在陰性（溶劑）對(duì)照組和所有受試物濃度組中保持一致，并且無(wú)細(xì)胞毒性。如果化學(xué)物質(zhì)不溶于水，則推薦使用二甲基亞砜(DMSO)和乙醇（EtOH）作為溶劑。如果化學(xué)物質(zhì)難溶于水、DMSO和乙醇，也可使用其他低細(xì)胞毒性的溶劑。在使用溶劑前，必須仔細(xì)評(píng)估它們的特殊性質(zhì)，例如，是否與受試物反應(yīng)，是否會(huì)引發(fā)光毒性、使光毒性效應(yīng)猝滅，在溶劑中原子團(tuán)捕獲特性和/或化學(xué)穩(wěn)定性。對(duì)于溶解在有機(jī)溶劑DMSO或乙醇中的受試化學(xué)物，用同一溶劑制備8個(gè)濃度的系列稀釋液，并將在有機(jī)溶劑中制備的8個(gè)濃度的儲(chǔ)備溶液轉(zhuǎn)移到水性溶液（如EBSS或HBSS）中，然后再用應(yīng)于細(xì)胞。每種受試化學(xué)物的儲(chǔ)備溶液應(yīng)以其在DMSO或乙醇中的最高溶解濃度制備，以使其在水性溶液中達(dá)到1000μg/mL的最大濃度。在所有8個(gè)測(cè)試濃度的水性溶液中溶劑的終濃度應(yīng)保持一致，通常為1%（v/v）。在有機(jī)溶劑中制備的受試化學(xué)物轉(zhuǎn)移到水性溶液前可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。因此，應(yīng)評(píng)估水溶性稀釋液的溶解度并記錄觀察結(jié)果。不影響受試物穩(wěn)定性的情況下，可以使用渦旋混合、超聲處理和/或加熱到適當(dāng)溫度等方法輔助溶解。5.2.5照射條件光源.1選擇合適的光源（如太陽(yáng)模擬器）和濾光片是光毒性試驗(yàn)關(guān)鍵的因素。體內(nèi)光毒性反應(yīng)通常與UVA和可見(jiàn)光區(qū)域相關(guān)，而與UVB相關(guān)性小，但UVB具有較高的細(xì)胞毒性。隨著波長(zhǎng)從313nm到280nm變化，細(xì)胞毒性增加約1000倍。合適的光源發(fā)出全波段光譜（290nm~700nm），可使用濾光鏡來(lái)調(diào)整光譜，以減弱UVB，同時(shí)允許UVA和可見(jiàn)光透過(guò)（見(jiàn)附錄B圖B.1）。此外，所用波長(zhǎng)、劑量和使用的光源設(shè)備(如開(kāi)放或封閉系統(tǒng))不應(yīng)對(duì)測(cè)試系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響(如紅外區(qū)域的熱/波長(zhǎng)發(fā)射)。.2用太陽(yáng)光模擬器模擬太陽(yáng)光是一種理想的人造光源。經(jīng)濾過(guò)的太陽(yáng)光摸擬器發(fā)出的光能分布應(yīng)接近于室外自然光。氙弧燈和（摻雜）汞金屬的鹵化物燈常被用作太陽(yáng)光模擬器。后者具有散熱少和價(jià)格便宜的優(yōu)點(diǎn)，但與太陽(yáng)光的接近程度不如氙弧燈。由于所有太陽(yáng)光模擬器都發(fā)射出相當(dāng)數(shù)量的UVB，因此，它們應(yīng)經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾以削弱UVB波長(zhǎng)的高細(xì)胞毒性。.3由于所有細(xì)胞培養(yǎng)塑料材料都含有UV穩(wěn)定劑，因此應(yīng)檢測(cè)透過(guò)同類型96孔板蓋的光譜。通過(guò)濾光片或設(shè)備無(wú)法避免的濾波效應(yīng)來(lái)減弱光譜，采取這些措施后，濾光片下測(cè)得的光譜不應(yīng)偏離標(biāo)準(zhǔn)的室外自然光范圍。ISODIS18909:2006中提供了國(guó)際公認(rèn)的室外自然光源標(biāo)準(zhǔn)——D65標(biāo)準(zhǔn)光源。經(jīng)濾過(guò)的太陽(yáng)光摸擬器光譜分布資料見(jiàn)附錄B圖B.1。劑量.1每次進(jìn)行光毒性測(cè)試前，應(yīng)用一個(gè)合適的寬波段紫外線-照度計(jì)對(duì)光強(qiáng)度（輻照度）做常規(guī)檢測(cè)，透過(guò)試驗(yàn)所用的96孔板蓋的光輻照度（光強(qiáng)度）也應(yīng)檢測(cè)。UVA照度計(jì)須經(jīng)光源校準(zhǔn)。在更大的時(shí)間間隔內(nèi)，應(yīng)使用外部校準(zhǔn)的參考紫外可見(jiàn)照度計(jì)到現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量過(guò)濾光源的光輻照度，并在需要時(shí)調(diào)整寬波段-UVA照度計(jì)的校準(zhǔn)?；蛟谂鋫淞讼嗤墓庠?濾光片設(shè)備的中央校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)UVA照度計(jì)進(jìn)行定期校準(zhǔn)。.2劑量為5J/cm2的光線（UVA范圍內(nèi)測(cè)定）證實(shí)對(duì)BALB/c3T3細(xì)胞無(wú)毒性作用，但足以有效地激發(fā)化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生光毒性反應(yīng)。如，50min內(nèi)達(dá)到5J/cm2劑量，輻照度（光強(qiáng)度）調(diào)到1.7mW/cm2，見(jiàn)附錄B圖B.2。光照射暴露時(shí)間按公式（1）計(jì)算：輻照度(光強(qiáng)度)(mW/cm2)×60.3如果使用其他細(xì)胞系或不同的光源，照射劑量必須校準(zhǔn)，以使劑量的選擇對(duì)細(xì)胞無(wú)害并足以對(duì)標(biāo)準(zhǔn)光毒性物質(zhì)（如表2列明的參考化學(xué)物質(zhì)）產(chǎn)生激發(fā)作用。5.3試驗(yàn)條件5.3.1受試物濃度應(yīng)當(dāng)通過(guò)劑量范圍試驗(yàn)（預(yù)試驗(yàn)）確定有光照（+Irr）和無(wú)光照（-Irr）條件下受試物的濃度范圍，預(yù)試驗(yàn)對(duì)于評(píng)估受試物在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和60min內(nèi)（或其他任何處理時(shí)間）的溶解性很有幫助，因?yàn)槿芙庑钥赡茉谠囼?yàn)期間或暴露過(guò)程中發(fā)生變化。為避免不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，以及由強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性化合物質(zhì)產(chǎn)生的毒性，添加了受試物的細(xì)胞培養(yǎng)基的pH范圍應(yīng)為6.5～7.8。受試物最高濃度應(yīng)在生理試驗(yàn)條件下確定，例如應(yīng)避免出現(xiàn)滲透性和極端的pH情況。根據(jù)受試物性質(zhì)不同，有必要考慮限制受試物最高試驗(yàn)濃度的其他物理化學(xué)因素。溶解性低的化學(xué)物質(zhì)，如果其最高溶解飽和點(diǎn)不具有毒性，則應(yīng)當(dāng)用該物質(zhì)所能達(dá)到的最高溶解濃度進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于非細(xì)胞毒性化學(xué)物質(zhì)（無(wú)IC50值直至產(chǎn)生沉淀則應(yīng)證明其在測(cè)定條件下的溶解度限制；在這種情況下，可在主實(shí)驗(yàn)中包括兩個(gè)或三個(gè)可能發(fā)生沉淀的濃度，然后在光毒性試驗(yàn)中排除這些濃度。受試化學(xué)物的最大濃度不應(yīng)超過(guò)1000μg/mL，在許多情況下，最大濃度可以降低至100μg/mL，因?yàn)樵诖讼拗禌](méi)有任何明顯細(xì)胞毒性（輻照條件下）的化合物可被認(rèn)為沒(méi)有相關(guān)的光毒性。考慮在沒(méi)有輻照的情況下使用更高的最大濃度來(lái)確定用于光刺激因子(PIF)計(jì)算的IC50值。8個(gè)受試物濃度的幾何稀釋序列應(yīng)采用一致的稀釋因子。如果有資料表明（如范圍確定試驗(yàn)）在無(wú)光照試驗(yàn)條件下（-Irr）受試物在達(dá)到限度濃度時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性，但在有光照條件下（+Irr）具有較高的細(xì)胞毒性，這時(shí)，有光照試驗(yàn)（+Irr）濃度范圍的選擇應(yīng)不同于無(wú)光照試驗(yàn)（-Irr）濃度范圍的選擇，以符合質(zhì)量控制的要求。5.4質(zhì)量控制5.4.1受試物濃度細(xì)胞光敏感性，建立歷史數(shù)據(jù)應(yīng)該至少一次通過(guò)暴露于越來(lái)越高劑量的光線評(píng)估細(xì)胞活性，以檢查工作細(xì)胞庫(kù)對(duì)光線的敏感性。應(yīng)使用傳代數(shù)最高的細(xì)胞來(lái)檢查其對(duì)UV的敏感性。包括高于體外3T3NRU光毒性試驗(yàn)使用劑量在內(nèi)的多個(gè)劑量的照射水平都可用于這一檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定光源的UV部件可較為容易地對(duì)這些照射劑量水平加以定量。細(xì)胞按本文件描述的密度接種，次日進(jìn)行照射（見(jiàn)試驗(yàn)步驟部分）。第三天采用中性紅攝取法檢測(cè)細(xì)胞活性。檢測(cè)結(jié)果應(yīng)表明最高無(wú)細(xì)胞毒性劑量（如5J/cm2UVA并足以對(duì)參考化學(xué)物質(zhì)（表2）進(jìn)行正確分類。5.4.2光線敏感性，檢查當(dāng)前試驗(yàn)試驗(yàn)應(yīng)符合的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：有光照條件下（+Irr）溶劑（陰性）對(duì)照組的細(xì)胞活性與無(wú)光照條件下（-Irr）溶劑（陰性）對(duì)照組的細(xì)胞活性相比大于80%。5.4.3溶劑對(duì)照的活性溶劑（陰性）對(duì)照組中性紅提取物測(cè)得的絕對(duì)光密度（OD540±10NRU）表明在試驗(yàn)的兩天內(nèi)以1×104個(gè)細(xì)胞/孔密度接種的細(xì)胞是否以正常的倍增時(shí)間生長(zhǎng)。試驗(yàn)應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：溶劑對(duì)照組平均OD540±10NRU≥0.4，即約20倍于背景溶劑吸光值。5.4.4避免中性紅溶液結(jié)晶7GB/T21769—XXXX在中性紅（NR）與細(xì)胞一起孵育期間，應(yīng)注意NR溶液的結(jié)晶，因?yàn)榫w可能會(huì)導(dǎo)致高變異性。中性紅溶液pH值的變化可能會(huì)引發(fā)NR晶體的形成。在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加pH穩(wěn)定劑（例如HEPES）可以防止結(jié)晶。由于不同供應(yīng)商產(chǎn)品的質(zhì)量可能不同，建議實(shí)驗(yàn)前對(duì)儲(chǔ)備的中性紅進(jìn)行檢查看是否適合用于試驗(yàn)。強(qiáng)烈推薦對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中的中性紅溶液進(jìn)行過(guò)濾或離心。5.4.5陽(yáng)性對(duì)照每一次光毒性試驗(yàn)都應(yīng)同時(shí)用某個(gè)已知的光毒性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。推薦使用氯丙嗪（Chlorpromazine，CPZ）。根據(jù)歷史數(shù)據(jù)，試驗(yàn)可接受標(biāo)準(zhǔn)為：a）CPZ有光照(+Irr)：IC50=0.1μg/mL～2.0μg/mL，b）CPZ無(wú)光照(-Irr)：IC50=7.0μg/mL～90.0μg/mL，c）光刺激因子(PIF)：PIF>6。應(yīng)監(jiān)測(cè)陽(yáng)性對(duì)照的歷史數(shù)據(jù)。每個(gè)進(jìn)行該試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立包括平均光效應(yīng)（MPE）的歷史數(shù)據(jù)庫(kù)，以監(jiān)測(cè)一段時(shí)間內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照物的性能（表2）。其他光毒性化學(xué)物質(zhì)，若其化學(xué)分類或溶解性已被評(píng)估過(guò)，亦可替代CPZ用作陽(yáng)性對(duì)照物。5.5試驗(yàn)步驟5.5.1第一天加100μL培養(yǎng)基于96孔組織培養(yǎng)板的外圍孔（空白對(duì)照在其余孔中加入100μL密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液（=1×104個(gè)細(xì)胞/孔）。每次試驗(yàn)都應(yīng)制備兩個(gè)板，包括相同的受試物濃度序列，包含溶劑對(duì)照。同樣地，陽(yáng)性對(duì)照物也應(yīng)準(zhǔn)備兩個(gè)板，包含溶劑對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)18h～24h直至形成半融合單層。在此培養(yǎng)期間細(xì)胞恢復(fù)活力、貼附和指數(shù)增長(zhǎng)。5.5.2第二天去除培養(yǎng)液，用150μL孵育緩沖液輕洗兩次。加100μL含適當(dāng)濃度受試物或溶劑（溶劑對(duì)照）的緩沖液到孔中。將8個(gè)不同濃度的受試物加到兩塊培養(yǎng)板上。在暗處孵育含受試物的細(xì)胞60min。兩塊有8個(gè)不同濃度的受試物和對(duì)照的培養(yǎng)板隨機(jī)選擇，其中一塊用于檢測(cè)細(xì)胞毒性（-Irr即對(duì)照板；另一塊用于檢測(cè)光細(xì)胞毒性（+Irr即處理板。處理板進(jìn)行+Irr暴露，以無(wú)細(xì)胞毒性的最高光線劑量（即5J/cm2，見(jiàn)附錄B）透過(guò)96孔板蓋室溫下照射約50min，在室溫下將對(duì)照板（-Irr）置于黑暗條件下約50min（=光暴露時(shí)間）。去除試驗(yàn)溶液，用150μL孵育用不含受試物的緩沖液小心洗兩次。用培養(yǎng)基代替緩沖液孵育過(guò)5.5.3第三天顯微鏡觀察相差顯微鏡察細(xì)胞生長(zhǎng)情況、形態(tài)和細(xì)胞單層的完整性。記錄細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)的變化。中性紅攝取試驗(yàn).1用150μL預(yù)溫至37℃的緩沖液沖洗細(xì)胞。去除緩沖液。加100μL含50μg/mL中性紅無(wú)血清的培養(yǎng)基，按照5.2.2孵育3h。中性紅溶液可以按以下方式配制：a）中性紅原液：稱取0.4g中性紅染料，溶于100mL一級(jí)水中（室溫避光可保存2個(gè)月8b）中性紅使用液：在79mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中加入1mL中性紅原液，即為使用液，終濃度為50μg/mL。NR培養(yǎng)基應(yīng)在37oC下孵育過(guò)夜，然后以600xg離心力離心10min，或過(guò)濾（如微孔濾膜過(guò)濾以去除NR晶體，確保NR培養(yǎng)基不含晶體。.2孵育后，去除中性紅培養(yǎng)基，用150μL緩沖液清洗細(xì)胞。以吸干或離心方式傾倒和去除多余緩沖液。.3準(zhǔn)確加150μL中性紅洗脫液（一級(jí)水、乙醇、乙酸按49:50:1的比例新鮮配制）。.4將96孔板置于微量滴定板振蕩器上輕輕搖動(dòng)至少10min，直到中性紅從細(xì)胞中提取出來(lái)并形成均勻溶液。.5用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀在540±10nm下以空白孔為參照測(cè)定中性紅提取物的光密度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用電子格式保存，便于后續(xù)分析。6試驗(yàn)結(jié)果6.1試驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量和數(shù)量6.1.1在有光照和無(wú)光照下通過(guò)濃度-反應(yīng)試驗(yàn)選擇合適的濃度，以便得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)都能進(jìn)行有意義的分析。如果可能，測(cè)定使細(xì)胞活性降低到50%的測(cè)試化學(xué)物質(zhì)的濃度（IC50）。如果觀察到細(xì)胞毒性，可以重新設(shè)置測(cè)試濃度范圍以獲得濃度-反應(yīng)范圍（例如導(dǎo)致細(xì)胞活性高于和低于50%的濃度）。6.1.2對(duì)于明顯陽(yáng)性和明顯陰性的結(jié)果，除此主試驗(yàn)外，再加上一個(gè)或多個(gè)范圍確定試驗(yàn)支撐就足夠了，無(wú)需做重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。6.1.3模棱兩可的、臨界范圍附近的和不清晰的結(jié)果需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行澄清，在這種情況下，應(yīng)該考慮改變?cè)囼?yàn)條件。試驗(yàn)條件的改變可能包括濃度范圍或間距、孵育時(shí)間、照射暴露時(shí)間等。對(duì)于水不穩(wěn)定性化學(xué)物縮短暴露時(shí)間或許比較合適。6.2試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)6.2.1為評(píng)價(jià)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，可計(jì)算光刺激因子（PIF）或平均光效應(yīng)（MPE）。6.2.2為計(jì)算光細(xì)胞毒性的數(shù)值，必須通過(guò)適當(dāng)?shù)倪B續(xù)濃度-反應(yīng)曲線（模型）對(duì)離散的濃度反應(yīng)值進(jìn)行約算。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合通常采用非線性的回歸方法，為評(píng)估數(shù)據(jù)變異性對(duì)擬合曲線的影響，推薦采用自舉法程序（bootstrapprocedure）進(jìn)行分析。6.2.3預(yù)測(cè)模型1：光刺激因子（PIF）如果在有光照（+Irr）和無(wú)光照（-Irr）兩種情況下都得到完整的濃度響應(yīng)曲線，通過(guò)公式（2）計(jì)算PIF值：IC50(?Irr)IC50(+Irr)式中：PIF——光刺激因子；IC50（-Irr）——無(wú)光照（-Irr）情況下抑制50%細(xì)胞活性的受試物濃度（IC50）；IC50（+Irr）——有光照（+Irr）情況下抑制50%細(xì)胞活性的受試物濃度（IC50）。如果在有光照（+Irr）或無(wú)光照（-Irr）的情況下無(wú)法計(jì)算IC50，無(wú)法確定受試物的PIF。9GB/T21769—XXXX6.2.4預(yù)測(cè)模型2：平均光效應(yīng)（MPE）平均光效應(yīng)（MPE）是一種基于比較完全濃度反應(yīng)曲線的計(jì)算方法，它的定義是指全部具有代表性的光效應(yīng)數(shù)值的加權(quán)平均數(shù)。MPE的值通過(guò)公式（3）計(jì)算：式中：MPE——平均光效應(yīng)；PEc——任何一個(gè)濃度（C）的光效應(yīng)（PEC）。任何一個(gè)濃度（C）的光效應(yīng)（PEC）是指反應(yīng)效應(yīng)（REC）和劑量效應(yīng)（DEC）的乘積，即PEc=REc×DEc。反應(yīng)效應(yīng)（REC）是指無(wú)光照和有光照觀察到的反應(yīng)之間的差別，即REC＝RC（-Irr）-RC（+Irr）。劑量反應(yīng)由公式（4）得出：式中：DEC——?jiǎng)┝啃?yīng)；C——濃度；C*——等值濃度，即濃度為C的-Irr反應(yīng)相當(dāng)于+Irr時(shí)反應(yīng)的濃度。其中C*代表等值濃度，即濃度為C的-Irr反應(yīng)相當(dāng)于+Irr時(shí)反應(yīng)的濃度，如果由于+Irr曲線中的反應(yīng)值整體高于或低于Rc（-Irr）而使C*不能得出，則劑量效應(yīng)定為1。加權(quán)因子Wi由最高反應(yīng)值得出，即Wi＝MAX{Ri（+IrrRi（-Irr）}。格子濃度Ci指選擇落在由試驗(yàn)濃度的值確定的每個(gè)濃度間隔內(nèi)的相同數(shù)量的點(diǎn)。MPE的計(jì)算嚴(yán)格局限于最高濃度下的兩條曲線中，至少有一條曲線的反應(yīng)值仍出現(xiàn)至少10%的情況。如果這一最高濃度高于+Irr試驗(yàn)中的最高濃度，則+Irr的殘余部分設(shè)定為反應(yīng)值“0”。依據(jù)MPE的值是否大于正常選擇設(shè)定的臨界值（MPEc≥0.15對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行光毒性分類。6.2.5計(jì)算PIF和MPE的軟件包可從OECD官方網(wǎng)站獲得。6.3結(jié)果解釋6.3.1由預(yù)測(cè)模型得出的數(shù)值，如果：a）受試物PIF<2，或受試物MPE<0.1，預(yù)測(cè)“無(wú)光毒性”；b）2≤受試物PIF<5，或0.1≤受試物MPE<0.15，預(yù)測(cè)“可能具有光毒性”；c）受試物PIF≥5，或受試物MPE≥0.15，預(yù)測(cè)“光毒性”；d）藥用化學(xué)品適用于其他指南。表1試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)模型備注：*藥用化學(xué)品與全身性藥物的相關(guān)性不太明確，通常不需要進(jìn)行進(jìn)一步的6.3.2對(duì)于任何一間準(zhǔn)備建立這一檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)在進(jìn)行受試物光毒性檢測(cè)前先用列于表2的參考化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)得到的PIF值和MPE值應(yīng)接近于表2中所列數(shù)值。表2參考化學(xué)物質(zhì)的光毒性測(cè)定數(shù)據(jù)是是Norfloxacin是蒽是ProtoporphyrinIX,Dis是否否否無(wú)吸收，水6.3.3數(shù)據(jù)說(shuō)明如果光毒性效應(yīng)只在最高試驗(yàn)濃度（特別是水溶性受試物）時(shí)獲得，要評(píng)價(jià)此受試物的危害性可能還需做進(jìn)一步考慮，包括受試物皮膚吸收性和累積的可能性，或進(jìn)行其他試驗(yàn)，例如ROS（活性氧）測(cè)定、化學(xué)物質(zhì)的體外動(dòng)物皮膚、人類皮膚或皮膚模型的檢測(cè)。體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)得到的陰性結(jié)果（PIF<2或MPE<0.1）表明受試物在試驗(yàn)所用的培養(yǎng)條件下對(duì)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)光毒性。7試驗(yàn)報(bào)告7.1試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包含以下信息7.1.1受試物——證明材料，統(tǒng)一名稱，IUPAC（InternationalUnionofPureandAppliedChemistry）和CAS編碼（如果已知——物理性質(zhì)和純度；——與試驗(yàn)相關(guān)的物理化學(xué)特性；GB/T21769—XXXX——UV/vis吸收光譜；——穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性（如果已知）。7.1.2溶劑——溶劑選擇的理由；——受試物在溶劑中的溶解性；——處理培養(yǎng)基中溶劑的百分比。7.1.3細(xì)胞——細(xì)胞類型和來(lái)源；——無(wú)支原體和其他污染；——細(xì)胞傳代數(shù)；——特定傳代范圍細(xì)胞的光線敏感度，用光毒性試驗(yàn)中相同的光照設(shè)備測(cè)定。7.1.4試驗(yàn)條件（1處理前后的孵育——培養(yǎng)基的類型和組成；——孵育條件（CO2濃度，溫度，濕度——孵育時(shí)間（處理前，處理后）。7.1.5試驗(yàn)條件（2用受試物處理——有光照和無(wú)光照條件下，選擇受試物濃度的理由；——受試物溶解度有限而且無(wú)細(xì)胞毒性的情況下，最高濃度試驗(yàn)的理由；——處理培養(yǎng)基的類型和組成（緩沖鹽溶液——化學(xué)物處理持續(xù)時(shí)間。7.1.6試驗(yàn)條件（3光照——所用光源選擇的理由；——光源和照度計(jì)的制造商和類型；——光源的發(fā)光光譜特性；——所用的濾光器的發(fā)射和吸收特性；——照度計(jì)的特性及其校準(zhǔn)的詳細(xì)資料；——光源與試驗(yàn)系統(tǒng)的距離；——在此距離內(nèi)的UVA輻照度，以mW/cm2表示；——暴露于UV/vis下的持續(xù)時(shí)間；——UVA劑量（輻照度×?xí)r間以J/cm2表示；——光照期間細(xì)胞培養(yǎng)的溫度和同時(shí)放置在暗處的細(xì)胞培養(yǎng)溫度。7.1.7試驗(yàn)條件（4）：中性紅活性試驗(yàn)——中性紅處理培養(yǎng)基的組成；——中性紅孵育時(shí)間；——孵育條件（CO2，溫度，濕度——中性紅提取的條件（提取劑，時(shí)間——用于讀取中性紅光密度的分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）的波長(zhǎng)；——第二波長(zhǎng)（參考如果使用；——分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）空白的容量，如果使用。7.1.8結(jié)果——每個(gè)受試物濃度得到的細(xì)胞活性，以平均活性百分率表示，同時(shí)測(cè)定溶劑對(duì)照；——同時(shí)進(jìn)行的+Irr和-Irr試驗(yàn)中獲得的濃度反應(yīng)曲線（受試物濃度對(duì)相對(duì)細(xì)胞活性——濃度-反應(yīng)曲線的數(shù)據(jù)分析，可能的話，列出電腦或人工計(jì)算IC50（+Irr）和IC50（-Irr）的方法；——比較在有光照和無(wú)光照下獲得的兩個(gè)濃度反應(yīng)曲線，通過(guò)PIF或通過(guò)MPE計(jì)算；——試驗(yàn)接受標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)進(jìn)行溶劑對(duì)照；——有光照和無(wú)光照條件下細(xì)胞絕對(duì)活性（NR提取物的光密度——陰性和溶劑對(duì)照的歷史數(shù)據(jù)，平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差；——試驗(yàn)接受標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)進(jìn)行的陽(yáng)性對(duì)照——陽(yáng)性對(duì)照化學(xué)物的IC50（+Irr）和IC50（-IrrPIF或MPE；——陽(yáng)性對(duì)照化學(xué)物的歷史實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：IC50（+Irr）、IC50（-Irr）、PIF和MPE，平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。7.2結(jié)果討論7.3結(jié)論GB/T21769—XXXX（資料性）3T3NRU光毒性試驗(yàn)在化學(xué)物質(zhì)光毒性連續(xù)試驗(yàn)中的作用A.13T3NRU光毒性試驗(yàn)在化學(xué)物質(zhì)光毒性連續(xù)試驗(yàn)中的作用,見(jiàn)圖A.1。受試物物理、化學(xué)和毒理學(xué)特性的初步評(píng)價(jià)?物理-化學(xué)特性?化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)警示?UV/vis-吸收?QSAR-光化學(xué)?一般毒性（包括毒性動(dòng)力學(xué)和代謝）考慮不必進(jìn)行光毒性試驗(yàn)無(wú)吸收即考慮不必進(jìn)行光毒性試驗(yàn)無(wú)吸收即MEC<1000L/(mol·cm)在適當(dāng)?shù)娜軇┲蠻V/vis-吸收光譜（如OECDTG101）吸收即MEC>1000L/(mol·cm)體外3T3NRU光毒性試驗(yàn)必要時(shí)同時(shí)進(jìn)行或選擇其他方法備注：某些監(jiān)管指南可能使用了較老的MEC值。MEC>1000L/(mol·cm)基于科學(xué)數(shù)據(jù)獲得。圖A.13T3NRU光毒性試驗(yàn)在化學(xué)物質(zhì)光毒性連續(xù)試驗(yàn)中的作用光模擬器的譜能和細(xì)胞的敏感性B.1光模擬器譜能分布圖B.1顯示了一個(gè)可接受的經(jīng)濾過(guò)的光模擬器的光譜能量分布，資料來(lái)源于3T3NRU光毒性驗(yàn)證試驗(yàn)中（摻雜）金屬鹵化物燈。分別顯示兩個(gè)不同濾光片和96孔培養(yǎng)板蓋的濾過(guò)效果。H2濾光片僅用于能耐受高劑量UVB的試驗(yàn)系統(tǒng)（如皮膚模型試驗(yàn)和紅