常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光 PCR 方法

GB/TXXXXX—XXXX

常見畜禽動物源性成分檢測方法實時熒光PCR方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了常見畜禽動物源性成分的實時熒光PCR檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品、飼料、動物組織、動物產(chǎn)品及制品中常見畜禽（水牛、黃牛、牦牛、綿羊、

山羊、豬、駱駝、馬鹿、梅花鹿、馴鹿、兔、狗、雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、火雞）及其他可能摻假品

種（貓、狐貍、水貂、貉、鼠）物種成分的Taqman探針實時熒光PCR定性檢測，最低檢出限（LOD）

達1%（質(zhì)量分數(shù)）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

實時熒光PCRrealtimePCR

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR擴增過程。

3.2

Ct值cyclethreshold

每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4原理

利用實時熒光PCR技術(shù)，根據(jù)不同物種的特異性基因序列對常見畜禽動物源性成分進行鑒定。以

提取的DNA為模板進行內(nèi)參照基因的實時熒光PCR檢測，以確定樣品DNA的提取質(zhì)量；通過物種特

異性引物及探針進行畜禽動物源性成分的實時熒光PCR擴增，根據(jù)PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒

光信號的強弱判定，實現(xiàn)對常見畜禽動物源性成分的定性檢測。

5檢測用引物和探針

內(nèi)參照引物探針序列和常見畜禽動物特異性引物探針序列見表1。探針5'端標(biāo)記熒光報告基團，3'

端標(biāo)記熒光淬滅基團。

表1引物探針序列

2

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靶標(biāo)物種序列基因來源

內(nèi)參照F：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA18SrRNA基因

R：AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT

P：CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC

黃牛F：GGTTTCATTTTAGCAATAGCATGGNADHdehydrogenase

R：GTCCAATCAAGGGTATGTTTGAGsubunit5(ND5)基因

P：ACAAATCTCAATACCTGAGACCTCCAACAGA

牦牛F：GACTAATATTCGAAAATCCCytb基因

R：CTCCTAGGAGGGAGCCGAAGTTTCAC

P：CAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTCCAT

水牛F：TTCATTGAYCTCCCTGCTCCATPase8基因

R：GGAATAGGCCGGTGAGGATT

P：ACTTTGGCTCTCTCC

駱駝F：ATTCTTTGCCTTCCACTTCACytb基因

R：AGCGTATGCGAATAGGAAAT

P：CCTACACGAAACAGGCTCTAATAACCCGAC

梅花鹿F：CCTACCACCGAAGCAATAGTGGCOI基因

R：GGTGCACTCTCAATAACTTCTGAGA

P：CACTGTAGCTACTCAAGAAGC

馬鹿F：TAGTTATGTAAACAAGACTG12SrRNA基因

R：ATAGACTGTAGTAGCAAGGAA

P：AGGACTTGGCGGTGCTTTAT

馴鹿F：CTCCCAGTACGAAAGGACCA16SrRNA基因

R：GGGCGGGATATGTTTGTGTA

P：CCAACTTTAATCAAGCGCCT

山羊F：TGGAGTAATCCTCCTGCTCCytb基因

R：GGATTGCTGAAAGAAGATTA

P：CATAGGCTATGTTTTACCATGAG

綿羊F：ACACAACTTCTACCACAACCCCytb基因

R：AAACAATGAGGGTAACGAGGG

P：ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA

鴿F：GAGCAACCCCTCAACGTACT16SrRNA基因

R：ACCTCCTCGTCGATATGGACTC

P：CCCCTCAACGTACTAACAGTAACCAGAC

鴨F：GGCCACACAAATCCTCACAGCytb基因

R：TGTGTTGGCTACTGAGGAGAAA

P：CCTACTGGCTATGCACTACACCGCAGAC

鵝F：CCACCGCGAATCCTCAATmtDNA基因

R：TCTTGTTTTTGGAGGATTTGTTCTC

P：CCATCGCAGAGCCTGGTCGATATTTTT

鵪鶉F：GGATCACTTTGCCCACTTTAA12SrRNA基因

3

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R：GGGTGACGGGCGGTATG

P：ATGGCCCTGAGGCAC

水貂F：GCTTCAATCCTCTATTTCATAACytb基因

R：GCTTCTTCCTTGAGTCTTA

P：CCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGT

貓F：CTGCTGTCTTACTACTTCTACOI基因

R：GGTGTTTAGGTTTCGATC

P：CACTTCCAGTCTTAGCAGCGG

兔F：TAATCGTCACCGCACATGCCCOI基因

R：CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA

P：ACAAGCCAGTTCCCGAAGCCTCCA

豬F：ATCTACATGATTCATTACAATTACatp8基因

R：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA

P：ATCTCAAACTACTCATACCCA

狗F：TCCAGGTAAACCCTTCTTCCCD-loop基因

R：TTACGAGCAAGGGTTGATGGT

P：GCATTAATGGTTTGCCCCATGCATATAAGC

狐貍F：TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTTCOI基因

R：GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG

P：CCCTGCACCTGGCCGGAGTC

貉F：AATCTTGCCTGGGTTTGGAACOI基因

R：CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA

P：CATACTACTCCGGGAAAA

雞F：CCCTCCTCCTTTCATCCTCATNADHdehydrogenase

R：GTCATAGCGGAACCGTGGATAsubunit1(ND1)基因

P：CTATGAATCCGGGCCTC

火雞F：GCCCTAACCCCTTAAGAAAAGAAT12SrRNA基因

R：AGTTGCTATGGCTAAGTCAAGTTTACAC

P：CTTGCTTGAGCCACACC

鼠F：ATTCCGCCCAATCACCCAAACytb基因

R：TTGGCCTCCGATTCATGTTAAGA

P：TACTGAATYCTAGTAGCCAACCT

注：F代表上游引物；R代表下游引物；P代表探針

6試劑

三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉等。

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實驗用水符合GB/T6682中一級水的要求。

7配置溶液

7.1主要試劑

4

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CTAB提取緩沖液：20g/LCTAB（cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），1.4mol/L

NaCl，0.1mol/LTris（trishydroxymethylaminomethane，三羥甲基氨基甲烷），0.02mol/LNa2EDTA

（Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt，乙二胺四乙酸二鈉），調(diào)節(jié)pH至8.0；CTAB沉淀液：

5g/LCTAB，40mmol/LNaCl；70%乙醇(V/V)；NaCl溶液(1.2mol/L)；蛋白酶K溶液（10mg/mL）。

7.2實時熒光PCR反應(yīng)混合液

12.5μL反應(yīng)體系包括：1U～2U（Unit，酶學(xué)單位)的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5mmol/L～4.0mmol/L

的Mg2+、0.2U～1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A，C，G)TPs、0.2mmol/L～0.4mmol/LdUTP、400

nmol/LROX染料(某些熒光PCR儀不需要ROX校正)。

8儀器設(shè)備

8.1實時熒光PCR儀。

8.2核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。

8.3恒溫水浴鍋。

8.4離心機：離心力≥12000g。

8.5pH計。

8.6烘箱。

8.7天平：感量0.01g。

9檢驗步驟

9.1樣品處理方法

將食品、飼料、動物組織、動物制品等待檢樣品研磨均勻，分裝三份，其中一份為檢樣，另外

兩份為留存樣品。

9.2DNA提取

稱取100mg樣品至一潔凈2.0mL離心管中，加入1000μLCTAB提取緩沖液和10μL蛋白酶K溶

液，置于65℃裂解1h，期間混勻幾次；取出后12000g離心10min，取上清液至一潔凈2.0mL離心

管中；加入0.7倍體積的三氯甲烷，振蕩混勻30s，12000g離心10min；取上清液600μL至一潔凈

2.0mL離心管中，加入2倍體積CTAB沉淀液，振蕩混勻30s，室溫靜置1h，12000g離心10min；

棄上清液，加入350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀后加入350μL三氯甲烷，振蕩混勻30s；

12000g離心10min，取上清液；加入0.8倍體積的異丙醇或2倍體積-20℃冰箱中預(yù)冷的無水乙醇混勻，

-20℃放置1h，12000g離心15min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000g離心10min，棄上

清，室溫下晾干；加入100μL雙蒸水，溶解沉淀，-20℃保存。

也可用等效DNA提取試劑盒提取模板DNA。

DNA提取過程中以水代替樣品設(shè)置提取空白對照，并置于每個提取系列中的最后。

9.3DNA濃度和純度的測定

使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA

的濃度按照式（1）計算，每個樣品重復(fù)測定三次，取平均值。通過OD260/OD280比值判斷提取DNA的

純度。若DNA的OD260/OD280值在1.7～2.1，濃度在5～100ng/μL，適宜實時熒光PCR擴增。

5

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C=A×N×50/1000??????????????????????????（1）

C——DNA濃度，單位為微克每微升（μg/μL）；

A——260nm處的吸光值；

N——核酸稀釋倍數(shù)。

9.4實時熒光PCR擴增

檢測過程中分別設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。以目標(biāo)物種提取的的DNA為陽性對照，以

已知不含目標(biāo)物種成分的樣品提取的DNA為陰性對照，以無菌水為空白對照。樣品、內(nèi)參照和對照設(shè)

置兩個平行的反應(yīng)體系，以Ct平均值作為最終結(jié)果。反應(yīng)體系的體積為25μL，體系組成見表2，反應(yīng)參

數(shù)見表3。

表2實時熒光PCR反應(yīng)體系組成

試劑名稱貯備液濃度加入PCR反應(yīng)體系的體積/μL

反應(yīng)混合液—12.5

5'端引物10μmol/L1

3'端引物10μmol/L1

探針10μmol/L1

DNA模板5～100ng/μL5

無菌水—補足至總體積為25

表3實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)

待測物反應(yīng)參數(shù)

內(nèi)參照95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

黃牛95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

牦牛95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

水牛95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

駱駝95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

梅花鹿95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

馬鹿95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

馴鹿95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

山羊95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

綿羊95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

豬95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

狗95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

鴿95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

火雞95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

鼠95℃10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)

狐貍95℃5min；95℃15s，60℃40s，40個循環(huán)

貉95℃5min；95℃15s，60℃40s，40個循環(huán)

雞95℃5min；95℃15s，60℃40s，40個循環(huán)

鴨95℃2min；95℃15s，65℃80s，40個循環(huán)

鵝95℃2min；95℃15s，65℃80s，40個循環(huán)

6

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鵪鶉95℃2min；95℃15s，65℃80s，40個循環(huán)

兔95℃10s；95℃5s，60℃30s，40個循環(huán)

水貂95℃10s；95℃5s，52℃10s，72℃34s，40個循環(huán)

貓95℃10s；95℃5s,，52℃10s，72℃34s，40個循環(huán)

注：反應(yīng)參數(shù)可以適當(dāng)調(diào)整

10質(zhì)量控制

以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效；

a）空白對照：熒光通道無熒光信號檢出，Ct值應(yīng)≥40.0；

b）陰性對照：熒光通道無熒光信號檢出，Ct值應(yīng)≥40.0；

c）陽性對照：熒光通道有熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值≤35.0；

d）內(nèi)參對照：有熒光對數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值<30.0。

11結(jié)果判定及表述

11.1結(jié)果判定

在符合第10章的情況下，被檢樣品進行檢測時：

a）如Ct值≤35.0，則判定為被檢樣品陽性，擴增靶標(biāo)序列參見附錄A；

b）如Ct值≥40.0，則判定為被檢樣品陰性；

c）如35.0<Ct值<40.0，則重復(fù)一次。如再次擴增后Ct值仍為<40.0，則判定被檢樣品陰性；

如再次擴增后Ct≥40.0，則判定被檢樣品陰性。

11.2結(jié)果表述

11.2.1結(jié)果為陽性者，表述為“檢出目標(biāo)物種成分”。

11.2.2結(jié)果為陰性者，表述為“未檢出目標(biāo)物種成分”。

12檢測過程中防止交叉污染的措施

按照GB/T27403中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。

7

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附錄A

（資料性附錄）

黃牛成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:MF169209.1）

ggtttcattttagcaatagcatggttcctaacaaatctcaatacctgagacctccaacagatcttcatactaaacccaagcgactcaaacatacccttgattggac

牦牛成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:GQ464309.1）

gactaatattcgaaaatcccatccactaataaaaattgtaaacaacgcattcattgaccttccagctccatcaaacatttcatcatggtgaaacttcggctccctcctag

gag

水牛成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:MH880269.1）

ttcattgatctccctgctccatcaaacatctcatcatgatgaaactttggctctctcctaggcatctgcctaattctgcaaatcctcaccggcctattcc

駱駝成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:MH110007.1）

attctttgccttccacttcatcctgccatttattatcacggccctagtagccgtacacctattattcctacacgaaacaggctctaataacccgacaggaatctcctcag

acatagacaaaatcccattccacccctactacacaattaaagacatcctaggagcactgctactaatattaattctccttattctcgtactgttctcaccagacttattag

gagatcctgacaactatactcccgctaaccccctcaatacaccaccacacattaagccggaatgatatttcctattcgcatacgct

梅花鹿成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:D14379.2）

cctaccaccgaagcaatagtggacactgtagctactcaagaagctttctcagaagttattgagagtgcacc

馬鹿成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:NC_039923.1）

tagttatgtaaacaagactgttcgccagagtactaccggcaatagcttaaaactcaaaggacttggcggtgctttatacccttctagaggagcctgttctataatcgat

aaaccccgataaacctcaccattccttgctactacagtctat

馴鹿成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:GU220719.1）

ctcccagtacgaaaggaccagagaaataaggccaactttaatcaagcgccttaaattaactaatgatttcatcttaattagatacacaaacatatcccgccc

山羊成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:LS992662.1）

tggagtaatcctcctgctcgcgacaatggccacagcattcataggctatgttttaccatgaggacaaatatcattttgaggggcaacagtcatcactaatcttctttca

gcaatcc

綿羊成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:KY786037.1）

Acacaacttctaccacaacccagaattaataacaacaaaaacaccgaaacaaaatactccttgagaaacaaaatgaacgaaaatctatttgcctctttcattacccc

tataatatttggtctccccctcgttaccctcattgttt

鴿成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:GQ240309.1）

gagcaacccctcaacgtactaacagtaaccagacccaatataattgaccaatggaccaagctaccccagggataacagcgcaatctcctccaagagtccatatc

gacgaggagg

鴨成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列(GenBank:EU914150.1)

ggccacacaaatcctcacaggcctcctactggctatgcactacaccgcagacacatcccttgctttctcctcagtagccaacaca

8

GB/TXXXXX—XXXX

鵝成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:AF363031）

ccaccgcgaatcctcaatcaaccccactggggccactaccatcgcagagcctggtcgatatttttcggttggggcgaccttggaggagaacaaatcctccaaaa

acaaga

鵪鶉成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:AM902516）

ggatcactttgcccactttaagatggccctgaggcacgtacataccgcccgtcaccc

水貂成分基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:HM106322.1）

gcttcaatcctctatttcataatcctcctagtcttcatgccaatcgtcagyattattgaaaataatctattaaaatgaagagtctttgtagtatatcaattacyttggtcttgt

aaaccaaaaatggagaaccctatctccctaagactcaaggaagaagc

貓成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:U20753.1）

ctgctgtcttactacttctatcacttccagtcttagcagcgggaatcactatattattaacagatcgaaacctaaacacc

兔成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:NC_001913.1COX1）

taatcgtcaccgcacatgcctttgtaataatcttctttatagtcatgcctattataattggaggcttcgggaactggcttgtccccctgataattggggctcctgacatag

豬成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列(Genbank:KY964306.1)

Atctacatgattcattacaattacatcaataattataacattatttattttattccaactaaaaatctcaaactactcatacccagcaagcccagaat

caaccgaactcaaaactcaaaaacatag

狗成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列(Genbank:KY700649.1)

tccaggtaaacccttcttccctcccctatgtacgtcgtgcattaatggtttgccccatgcatataagcatgtacataatattatattcttacatagga

catatcaactcaatctcacaattcattgatctgtcagcagtatcaaatgcatatcacttagtccaataagggcttaatcaccatgcctcgagaaac

catcaacccttgctcgtaa

狐貍成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:JF443559.1）

tggagcatcagtagaccttacaattttctccctgcacctggccggagtctcttcaattttaggagctattaatttcatcactactattatcaatataaaacctcccgcc

貉成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:AF028197.1）

aatcttgcctgggtttggaataatttcccatatcgttacatactactccgggaaaaaagaaccttttggttacataggaatagtctgagcaataatatctattggattctta

ggctttatcgtgtgagcccaccacatatttactg

鼠成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:KY611388.1）

attccgcccaatcacccaaaccctatactgaattctagtagccaacctcttcattttaacatgaatcggaggccaa

雞成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（Genbank:KY039437）

9

GB/TXXXXX—XXXX

ccccttaatgacatgccccaattaaacccaaacccatgattctccatcatactcctaacttgattcaccttctctctgcttatccaacccaaacttctttcattcactctaa

caaacaaccctgcaaacaaaattacaacaactaaacccacccc

火雞成分的基因擴增靶標(biāo)參考序列（GenBank:U83741.1）

gccctaaccccttaagaaaagaataaaggagcaggtatcaggcacactctaatgtagcccaagacgccttgcttgagccacacccccacgggtattcag

cagtaattaaccttaagcaataagtgtaaacttgacttagccatagcaact

_________________________________

10

ICS07.080

A40

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—XXXX

常見畜禽動物源性成分檢測方法

實時熒光PCR方法

Identificationofanimalingredientfromcommonlivestockandpoultry

Real-timePCR

點擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

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常見畜禽動物源性成分檢測方法實時熒光PCR方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了常見畜禽動物源性成分的實時熒光PCR檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品、飼料、動物組織、動物產(chǎn)品及制品中常見畜禽（水牛、黃牛、牦牛、綿羊、

山羊、豬、駱駝、馬鹿、梅花鹿、馴鹿、兔、狗、雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴿子、火雞）及其他可能摻假品

種（貓、狐貍、水貂、貉、鼠）物種成分的Taqman探針實時熒光PCR定性檢測，最低檢出限（LOD）

達1%（質(zhì)量分數(shù)）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

實時熒光PCRrealtimePCR

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR擴增過程。

3.2

Ct值cyclethreshold

每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4原理

利用實時熒光PCR技術(shù)，根據(jù)不同物種的特異性基因序列對常見畜禽動物源性成分進行鑒定。以

提取的DNA為模板進行內(nèi)參照基因的實時熒光PCR檢測，以確定樣品DNA的提取質(zhì)量；通過物種特

異性引物及探針進行畜禽動物源性成分的實時熒光PCR擴增，根據(jù)PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒

光信號的強弱判定，實現(xiàn)對常見畜禽動物源性成分的定性檢測。

5檢測用引物和探針

內(nèi)參照引物探針序列和常見畜禽動物特異性引物探針序列見表1。探針5'端標(biāo)記熒光報告基團，3'

端標(biāo)記熒光淬滅基團。

表1引物探針序列

2

GB/TXXXXX—XXXX

靶標(biāo)物種序列基因來源

內(nèi)參照F：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA18SrRNA基因

R：AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT

P：CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC

黃牛F：GGTTTCATTTTAGCAATAGCATGGNADHdehydrogenase

R：GTCCAATCAAGGGTATGTTTGAGsubunit5(ND5)基因

P：ACAAATCTCAATACCTGAGACCTCCAACAGA

牦牛F：GACTA